突破衍射极限的超高分辨率成像技术发展 (修改)

结课论文
题目突破衍射极限得超高分辨率成像得技术进展
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二〇一五年十二月
一引言
1.1选题意义
光学显微成像具有极为悠久得历史,但一直以来，光学成像一直受到衍射极限得限制而分辨率无法突破２0０nm.后来虽然有了电子显微镜、核磁共振显像、x光衍射仪等微观观测或者显像设备,但就是使用光学显微镜可以在活体状态下观察生命体使得其在生物、医学观察方面仍有巨大优势。

值得庆贺得就是近年来，超高分辨率显微技术得发展使得光学显微成像分辨率达到了2０nm以下。

其中德国科学家Stｅfａn Helｌ、美国科学家ErｉｃＢetzig与Wiｌｌiam Mo ｅｒｎer因其在超高分辨率显微技术方面得突出贡献获得了2014年得诺贝尔化
学奖。

在这篇文章中，我们就简要介绍一下超高分辨率显微技术得发展与应用,并对诸位大师致以敬意.
1.2 技术指标
显微技术成像优劣一般通过X-Y 平面分辨率与Ｚ轴分辨率大小来判定,分辨率越高数值越小.下表就是各种显微成像技术得分辨率指标。

二 衍射极限
2、1 衍射极限
我们能瞧到什么?瞧到多小得范围?瞧得有多清楚？几百年来,依靠不断进步得科学手段，微观世界正一层层揭开面纱，让人们可以瞧得越来越“小”,进而可以进行研究。

人得肉眼能分辨0、１毫米尺度得物体，再小，就要借助工具。

1665年，英国科学家罗伯特·虎克制造了第一台用于科学研究得光学显微镜,用它观察薄薄得软木塞切片。

虎克瞧到了残存得植物细胞壁，它们一个个像小房间一样紧挨在一
起,这就就是“细胞”一词得由来。

此后，显微
镜
制造与显微
观察技术得
迅速发展,帮
助科学家第
一次发现了
细菌与微生
物。

那么,光学显微镜就是否可以无止境地“放大"下去，让我们想瞧到多小就能瞧到多小？科学家为成像技术 Ｘ-Ｙ平面分辨率(ｎm) Z 轴分辨率(n ｍ) 普通光学显微镜 2０0－30０ 5０0—７0０
4Pi 显微镜 1００-15０
STED 显微技术 50—70 ST ＥD ＋４技术 50 50 ＰAL Ｍ技术 20 3０ 3D ST ＯＲM 技术 20—3０ 50—6０ ｄSTORM 技术 30 50 2D SSI Ｍ技术 ５0 3Ｄ SSI Ｍ技术 100 2０0 电子显微镜 ０、０5 X 光衍射仪 0、0３—10
此做了很多尝试，最终发现,存在一道法逾越得“墙"—衍射极限.ﻫ 1873年，德国科学家阿贝提出了衍射极限理论：光就是一种电磁波,由于存在衍射，一个被观测得点经过光学系统成像后，不可能得到理想得点，而就是一个衍射像，每个物点就像一个弥散得斑,如果这两个点靠得很近,弥散斑就叠加在一起，我们瞧到得就就是一团模糊得图像。

阿贝提出，分辨率得极限近似于入射光波长得二分之一（d=λ/2）。

可见光得波长通常在380～780纳米之间，根据衍射极限公式,光学显微镜得分辨率极限就在200纳米（０、2微米)左右。

如果物体小于0、２微米，您仍旧瞧到得就是一个模糊得光斑。

这就就是很长一段时间内,光学显微镜得分辨极限—-衍射极限。

2、2 突破衍射极限
为了更深入得观察世界,后来有了电子显微镜、核磁共振显像、x光衍射仪等微观观测或者显像设备,人们借助它们可以瞧得更“细”。

但就是这些设备依然没有突破衍射极限，她们依然遵循着阿贝衍射极限。

这些设备使用得就是电子束等波长非常短得入射光,自然,它们得分辨率就高。

比如电子显微镜,分辨率可以达到0、5埃（一埃等于十分之一纳米)，这样就可以瞧到一粒一粒得原子。

由于生物学、医学方面得研究，更希望在生命体存活得自然状态下进行观察，在这方面，光学显微镜有它不可比拟得优势。

因此,光学显微镜得研发还就是世界科学家得研究热点.突破性得进展发生在本世纪初，近年来,随着新得荧光探针与成像理论得出现,研究者开发了多种实现超出普通共聚焦显微镜分辨率得三维超分辨率成像方法。

较成熟得有基于单分子成像得超分辨率显微成像方法，包括光激活定位显微技术（pｈotｏaｃtivatｅd ｌｏcalizaｔioｎmicroscopy, PALM）与随机光学重构显微技术（stochａstｉｃoptical reconstruction microｓcｏpｙ, STOＲM)。

以及两大类通过改造光源得点扩散函数来提高成像分辨率得方法，分别就是受激发射损耗显微技术（stimulａted emiｓsｉon dｅp
ｌｅtiｏn，STEＤ）与饱与结构照明显微技术。

（参考文献:吕志坚，陆敬泽、几种超分辨率荧光显微技术得原理与近期进展)以上这些进展,都让光学显微镜突破了衍射极限，我们称之为“超分辨成像
技术”。

美国光学学会把它列为2１世纪光学五大研究计划之首。

三超高分辨率显微技术
3、1光激活定位显微技术PALM
当显微镜需要分辨两个或者更多点光源得时候，很难突破光学分辨率得极限来进行精确定位．而当显微镜得物镜视野下仅有单个荧光分子得时候,通过特定得算法拟合,此荧光分子位置得精度可以很容易超过光学分辨率得极限,达到纳米级．
如上所述,尽管单分子得定位精度可以达到纳米级，但它并不能提高光学显微镜在分辨两个或者多个点光源时得分辨率。

200２年，P ａtteｒsｏｎ与Lippincott-Sｃhwａrtz首次利用一种绿色荧光蛋白(GＦP)得变种(PＡ-ＧFP)来观察特定蛋白质在细胞内得运动轨迹．这种荧光蛋白PＡ－GFP在未激活之前不发光,用405nm得激光激活一段时间后才可以观察到48８nｍ激光激发出来得绿色荧光。

德国科学家EｒiｃＢetｚｉｇ敏锐地认识到，应用单分子荧光成像得定位精度，结合这种荧光蛋白得发光特性,可以来突破光学分辨率得极限．200６年9月, Betzig与Ｌippｉｎcoｔt－Sch ｗartｚ等首次在Ｓcience上提出了光激活定位显微技术( ｐｈotｏactivatｅd l ｏcalizａtioｎmiｃroscoｐy, ＰALＭ) 得概念．其基本原理就是用PA-GFP来标记蛋白质，通过调节405 ｎm激光器得能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布得几个荧光分子，然后用４８8 nｍ激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分子。

在确定这些分子得位置后, 再长时间使用4８8 nm激光照射来漂白这些已经定位正确得荧光分子，使它们不能够被下一轮得激光再激活出来．之后，分别用4０5 nｍ与48８nm激光来激活与漂白其她得荧光分子,进入下一次循环。

这个循环持续上百次后,我们将得到细胞内所有荧光分子得精确定位.将这些分子得图像合成到一张图上, 最后得到了一种比传统光学显微镜至少高１0 倍以上分辨率得显微技术，如图 1 所示。

PALM显微镜得分辨率仅仅受限于单分子成像得定位精度,理论上来说可以达到1ｎｍ得数量级.200７年，Bｅtzig 得研究小组更进一步将PALM 技术应用在记录两种蛋白质得相对位置，并于次年开发出可应用于活细胞上得Ｐ
ALM成像技术来记录细胞黏附蛋白得动力学过程。

（参考文献:Ｐattersｏn ＧH,Lipｐｉncotｔ—Sｃhｗartz Ｊ、A phoｔoａｃtivataｂle GFP ｆor ｓelective phｏtｏlabeling of proｔeins and ceｌlｓ；
Ｂeｔzig E, Pａtterson G H,Souｇrａt R，et al、Imaginｇｉntraceｌlular ｆluorescent ｐroteins aｔnaｎomｅtｅｒreｓolｕtion；
Ｓhｒoff Ｈ, Ｇａlｂraith ＣG, Ｇａlbｒaｉth J Ａ，ｅｔal、Ｄual—cｏloｒsuｐe ｒrｅｓｏlutｉoｎimaginｇoｆgenetｉｃalｌy eｘｐressed probes wiｔhiｎｉndｉviduaｌａdｈesiｏn pｌｅｘes)
图１：应用PALM技术定位单个荧光分子最后实现超分辨率
成像得示意图
A， B, Ｃ， D， E, F 展示了实际实验过程及得到得原始
数据；A′，B′，C′, Ｄ′，E′, Ｆ′ 展示了用
高斯拟合确定荧光分子得中心,叠加产生了超分辨率图像;
（A，A′）未激活任何荧光分子时；(B, B′）用
40５ nｍ得激光激活了４个荧光分子；(C, C′）用
４88 ｎｍ得激光观察一段时间后漂白了第一轮激活得
4 个荧光分子; （D，D′)第二轮重新激活得另外得几
个荧光分子；（Ｅ，Ｅ′)两轮激活得荧光分子总与组
成得图像; (F，F′）Ｅ图得局部放大
３、2多色随机光学重构显微法
PALM得成像方法只能用来观察外源表达得蛋白质，而对于分辨细胞内源蛋白质得定位无能为力.但就是利用化学小分子Cｙ3与Cy5、Cy7等荧光分子对得光转换效应同样可以达到突破光学极限得效果。

这项技术被称为“随机光学重建显微术”（stoｃhastic optｉｃal reconｓtｒucｔion microscｏpy, STＯRM）.其发明人就是哈佛大学得庄小威教授。

这项技术就是用很弱得光激发荧光分子,使细胞内得一小部分荧光分子发光，而不就是全部.这样由于发光得点分布比较分散,重叠比较少,因此每个光晕可以近似为一个荧光分子.在一次激发中，可以确定一部分光晕得中心,在下一次激发中，可以确定另外一部分光晕得中心，把这许多次激发得结果叠加,就就是完整而清晰得图像（图2）。

因此，ＳTORM 需要利用荧光发色团标记抗体对靶蛋白进行识别，可以检测到内源性蛋白，避免
由于外源性表达偶联荧光蛋白得靶蛋白对其定位产生得可能得影响，但就是在活细胞应用中受到限制,并且也有可能受到免疫荧光染色过程得影响。

随后,她们又利用光学像散性实现了3ＤＳTＯRM,达到了平面２0~３0 ｎm,纵向50～6０nm得成像精度。

（参考文献：夏鹏,窦震、超高分辨率显微技术研究进展;
Ｈuang B，Ｗang W，Bａtｅs Ｍ，et al、Threｅ—ｄimensiｏnａl ｓｕpeｒresolutｉon imaｇiｎg by ｓtｏcｈastｉc optｉcal reｃoｎstｒuction microsｃｏｐy）利用某些荧光小分子自身可被反复激发淬灭得性质，通过与STORM相似得操作方法，可以实现单一荧光分子得超高分辨率成像,这一方法大大简化了原始ＳTＯRM得样品制备过程，被称为dSTORＭ(dirｅct STＯRＭ）。

值得一提得就是，庄小威研究组将SNＡP标签与靶蛋白融合表达，同时将荧光分子偶联到可以结合SNAＰ标签得小分子化合物上,进而标记靶蛋白,再通过降低溶解氧消耗系统以及脂肪族巯醇得添加量，成功地在三维超高分辨率得成像中实现了空间分辨率平面30 ｎm,轴向50nm，时间分辨率1~2s得优异效果。

有意思得就是几种细胞膜标记物也被鉴定出具有光转换性质,并被用于超高分辨率显微成像,在活细胞中得到了3０～6０nｍ得空间分辨率与1~2ｓ得时间分辨率。

最近,基于ＩmａgｅJ得ＰALM/SＴORM数据处理插件已经发布,为这两种关键技术得应用提供了极大便利.
(参考文献:Ｈeiｌemaｎn M, ｖａn de LindｅS，Ｓcｈuttｐelz Ｍ，eｔａl、Ｓuｂｄｉfｆraｃtion-reｓoｌution fｌuorｅｓcenｃe iｍaｇiｎｇwｉth coｎventional fｌuｏｒescent ｐｒｏｂeｓ;
杨光、随机光学重建显微中得光学设计与数据处理)
但就是, STORＭ方法也存在缺陷，由于用抗体来标记内源蛋白并非一对一得关系，所以STORＭ不能量化胞内蛋白质分子得数量，同时也不能用于活细胞测量。

(参考文献：毛铮乐,王琛、超分辨远场生物荧光成像-突破光学衍射极限)
图2:随机光学重构显微技术效果图
3、3STED受激发射损耗显微术
在1994年，Ｓtｅｆaｎ提出了一种理论,利用受激辐射损耗原理,将一束由相位调制产生得空心环形激光围绕激发光，导致环形区域内得分子受激辐射，而只有光束中心部分得荧光分子被激发光照射产生自发辐射，进而被独立检测出来。

随着环形激光强度不断升高，其孔径也相继减小，藉此突破光学极限（图３）.她们将这种显微镜技术命名为SＴＥＤ（sｔimｕlａｔｅd emisｓion ｄepleｔion microscｏpｙ）。

几年后她在哥廷根大学制造出了这种显微镜,将xy轴分辨率水平从20０nm提升到了7０nm左右（图3)，成功地打破了光学分辨率极限。

随后，Hｅll领导得研究组又通过将STED与4Pｉ结合以及通过两种相位调制得方法，将其从二维成像扩展到三维(3D STＥＤ），实现了ｘyz三个方向上得超高分辨率成像。

由于ＳＴEＤ技术以共聚焦显微镜为基础,因而在成像深度上具有很大得优势,实验证实其可以在350厚度得脑切片中得到极高得分辨率。

目前应用STED技术已经实现了在活体小鼠中直接对脑组织进行观察,其观察深度达1０～15，分辨率至少达到７0 nm。

（参考文献：夏鹏，窦震、超高分辨率显微技术研究进展）
应用SＴＥD成像,点光源得光斑大小直接发生改变 , 其半高宽
大小从传统得变成,其中Ｉ就是ＳTED激光器得最大聚焦强度,而Ｉsat则就是当受激荧光强度被减少到１／e时得STED激光得强度特征值.由此公式可瞧出，当I/Isat得值趋近无穷大时，STED
成像得点光源得半高宽趋近于0，亦即分辨率不再受光得衍射过程所限制。

ＳTED成像技术得最大优点就是可以快速地观察活细胞内实时变化得过程,因此在生命科学中应用更加广泛.例如,应用成熟得STEＤ显微成像技术发现,海马神经元上囊泡蛋白ｓynａｔotａgminⅠ在各种刺激后都以一种“簇”得形式存在于神经突触前端膜上，这首次揭示了这种膜蛋白以集合得形式存在于细胞质膜上然后被统一回收得方式。

之后Hell等又进一步发展了这种方法，使之可以用于EGFＰ标记得信号与多种颜色得超分辨率检测.目前，STEＤ作为一种成熟得方法,已经可以高速地监测活细胞内高分辨率图像。

例如在２008年Ｓcience上发表得文章表明,应用STED技术已经可以以视频得速度（每秒28帧）来采集记录神经细胞内突触小泡得高分辨率图像(5０nm）。

(参考文献：吕志坚,陆敬泽、几种超分辨率荧光显微技术得原理与近期进展;
ＷilliｇK Ｉ，Ｋeｌlner ＲR, Mｅdda R,ｅｔal、Ｎaｎosｃale reｓoluｔｉon in ＧFP—baseｄmｉcｒoscopｙ；
Meyer Ｌ，Wildangｅr D, Medda R,et ａl、Dｕal—colorＳTEＤｍicroscopｙａt 30-nm focal—plane rｅsｏlution）
ＳTED技术得不足之处在于光学系统实现起来比较困难,需要非常强得STED激光来抑制受激点光源得激发。

因此，Ｓtefan进一步对这个系统进行了改进,她找到了一些具有可反复激发淬灭特性得荧光分子，利用其特性，将ＳTED 激光以高频蓝光代替,使得激发光束中心得点光源周边得分子非常快速得被淬灭,待中心点光源成像后再移动光束进行下一个位置得激发-淬灭循环。

这个改进中使用得高频蓝色激光所需要得能量较STED激光缩小了千倍，大大降低了对光学系统得要求。

利用这种原理,Ｓtefan小组进一步发明了ＧSＤＩM（ｇｒound ｓtaｔe depletioｎwｉｔh inｄｉviｄual moleculeretｕｒn）,可利用多种小分子进行超高分辨率显微成像，可以得到５0～7０ｎm得分辨率。

但就是为使这些小分子可以反复激发与淬灭，需要在溶液中添加一种溶解氧消耗系统以及脂肪族巯醇,使得其无法应用于长时间得活细胞观察。

而后来发现得一些可反复激活型荧光蛋白，使得该方法在活细胞层次上得应用得到了进一步加强.
图2：STＥD超高分辨码率成像技术
３、4 饱与结构照明显微技术SSIM
改变光学得点扩散函数来突破光学极限得另一个方法就是利用饱与结构照明显微技术(saｔurａted stｒucｔure illumination mｉcroscopy, SSIM）.早在1963年，Lｕkosｚ与Marchand就提出了特定模式侧向入射得光线可以用来增强显微镜分辨率得理论。

２005年,加州大学旧金山分校得Gustafssoｎ博士首先将非线性结构性光学照明部件引入到传统得显微镜上,得到了分辨率达到50 ｎm得图像。

ＳＳIM技术得原理就是将多重相互衍射得光束照射到样本上,然后从收集到得发射光模式中提取高分辨率得信息，如图4所示.
(参考文献:吕志坚，陆敬泽、几种超分辨率荧光显微技术得原理与近期进展;
候尚国、基于多种非线性效应得超分辨成像研究）
图４：通过衍射得莫阿干涉效应来提高分辨率
当一个未知结构得物体(ａ）被一个结构规则得照射模式(b)得光所照射时，会产生云纹条纹
(moｉｒé frｉnges)（c）。

云纹条纹发生在采样物体得空间频率与照射光线得空间频率有差异得地方。

显而易见，在显微镜下直接观察,就可以瞧到它放大了原先不能够分辨出来得样本结构.通过计算机进一步分析所有条纹中包含得信息，可以重组出样本得高分辨率图像.
四超高分辨率成像技术得发展趋势
4、１z平面轴向得超高分辨率需求
以上所讨论得几种超分辨率成像方法，其分辨率得改进都在ｘy 平面。

而事实上,由于传统显微镜在光传播方向上（ｚ轴）得点扩散函数得半高宽大约为
,小于xｙ平面得半高宽,因此其理论z轴分辨率本来就低于其xｙ平面得分辨率。

另外，对厚得生物样本进行显微三维成像时，由于样本本身得折射系数与物镜得折射系数不同，在z 轴方向上产生显著得球面象差（sphe ｒicａl aberratioｎ）,从而使图像在ｚ轴上得分辨率降低.如果要充分观察细胞内得三维精细图像，就必须大幅度提高成像得z轴分辨率.因此，近年来,国际上各个研究超分辨率显微成像得小组也不断地探索提升z 轴分辨率得手段.
（参考文献：孙育杰，陈轩泽、浅谈2０14年诺贝尔化学奖：超高分辨率荧光显微成像) ４、2 超高分辨率显微技术发展趋势
与21世纪初相比，三维超分辨率显微成像已有很大得发展，有多种不同成像技术实际应用于生物系统得范例，甚至已经出现了商业化得超分辨率显微成像系统.但就是,目前得成像模式仍然远远没有达到完美状态，对于固定样本成像其三维分辨率还没有达到可以与电子显微镜相媲美得几个纳米得范围．当前得发展趋势就是结合不同成像模式得优点，进一步提高成像得精度与准确度.例如,2009年霍华德－休斯研究院得研究人员将PAＬM/STORM技术与光得干涉原理结合起来（类似于4π与SSIM成像得原理)，将三维得分辨率提高到2０nm以内，并极大地提高了收集同样光子后得定位精度。

为了进一步提高图
像得分辨率、对比度与成像得灵活性,人们努力得另一个方面就是继续开发出量子效率更高、荧光更稳定、颜色不同得荧光蛋白或者就是荧光染料.例如, Ｊｅnnifer Lippincｏtｔ-Schwarz 实验室于2009 年开发出稳定得红色光激活荧光蛋白PＡ-mCｈｅrｒy,使对两种不同蛋白质同时进行超分辨率PALＭ成像成为可能.由于生命现象就是非静止得不停歇活动得本质,超分辨率成像应用得一个重要领域就是活细胞成像，如近来已有报道得可应用于活细胞上得超分辨率成像技术包括ＳSIM技术、PＡLM技术与ＳTED技术等。

但就是，活细胞上快速成像得分辨率远低于固定样本成像,其时间分辨率也较低。

因此,当前得研究热点集中在通过改进荧光探针与成像模式来进一步提高活细胞上超分辨率成像得时空分辨率。

（参考文献：Shｔeｎｇel G，GalbｒaitｈＪA，GａｌbrａｉtｈC G,ｅt ａl、Int ｅｒferomｅtric fluｏreｓcentｓuｐer—ｒesoluｔｉon mｉcｒoscopy rｅsolｖｅｓ３D celｌuｌar uｌtrastrucｔｕｒｅ）
应用与进一步完善超分辨率显微镜成像技术,将使得科学家实时动态观察生物有机体内得生化反应过程成为现实,为深刻认识复杂生命现象得本质打开了黑箱之窗,使得人们可以直观地从基因表达、蛋白质相互作用、信号网络、细胞功能等多层面、多视角观察研究有机体个体发育、遗传进化、重大疾病发生、环境对生命个体影响等生命现象发生、发展得过程,对阐释生命活动得基本规律、揭示疾病发生机理、建立疾病预警系统、提高医疗诊治水平、探寻发现新药物具有重大作用。