微生物原生质体融合育种技术及其应用

融合技术具有重组频率高、 受结合型或致育型限制小 以及遗传物质传递完整且不需要完全了解作用机制等 优点， 因而被国内外微生物育种学者广泛应用。
［ ２ ］ １ ９ ７ ４ 年， 匈牙利的 Ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｃ ｚ ｙ 成功将白地霉
Ｇ ｅ ｏ ｔ ｒ ｉ ｃ ｈ ｕ ｍｃ ａ ｎ ｄ ｉ ｄ ｕ ｍ ）营养缺陷型突变株的原生质体 （ 进行融合， 使原生质体融合技术首次应用于微生物中。 接下来的几十年， 该技术的基本实验方法逐步完善， 现 已作为一项十分有用的技术广泛应用于工业微生物菌 种选育中。本文就原生质体融合技术的过程及其应用 于微生物育种方面的最新进展做了简要综述， 并分析 了目前存在的问题及未来的发展方向。
中国生物工程杂志 Ｃ ｈ ｉ ｎ ａＢ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， ２ ０ １ ０ ， ３ ０ （ １ ） ： ９ ３ ９ ７
微生物原生质体融合育种技术及其应用
， ３ 毛 雨１ 王 丹２ 黄占斌１ 邢建民２ （ １中国矿业大学（ 北京） 化学与环境工程学院 北京 １ ０ ０ ０ ８ ３ ） ２中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室 北京 １ ０ ０ １ ９ ０ ３中国科学院研究生院 北京 １ ０ ０ ０ ４ ９ ） （
２ ＋ ２ ＋ ＋ 有助于融合， 而 Ｋ＋、 Ｎ ａ 则会降低融合率。Ｐ Ｅ Ｇ溶液一 ２ ＋
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质体时， 向酶解液中加入不同荧光色素， 使双亲原生质 体在特定波长下呈现不同颜色， 原生质体融合后， 直接
７ ］ 将链霉 选出带有两色荧光的融合子即可。龙建友等 ［
ｏ ． ２ ４菌株原生质体带上酚藏花红荧光标记， 将其 素Ｎ 诱变株 Ｍ ｓ ２ ４菌株原生质体带上伊文思蓝荧光标记， 融合后， 在荧光显微镜下筛选同时带有红蓝荧光的融 合子。 １ ． ３ ． ５ 利用某些特殊的生理特征作为标记筛选融合 子 利用亲本对营养物质利用及固氮能力方面的差异
１ ２ ］ 等［ 将Ａ ｓ ｐ ｅ ｒ ｇ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｎ ｉ ｇ ｅ ｒ 黑曲霉经过紫外或 Ｅ Ｍ Ｓ诱变
将两株高产
褐黄孢链霉菌（ Ｓ ｔ ｒ ｅ ｐ ｔ ｏ ｍ ｙ ｃ ｅ ｓ Ｇ ｉ ｌ ｖ ｏ ｓ ｐ ｏ ｒ ｅ ｕ ｓ ）Ｓ Ｇ ２ ０ ０ ２ １和 Ｓ Ｇ ２ ０ ０ ２ ２的原生质体分别经过紫外灭活和热灭活后 融合， 形成能够生长繁殖的融合子。这种方法省略了 对双亲株的遗传标记，使工作量大大降低，还避免了 亲本特性的改变。 １ ． ３ ． ４ 利用荧光染色标记筛选融合子 在制备原生
２ 原生质体融合技术的应用进展
２ ． １ 提高代谢产物的产量和质量 原生质体融合常用于抗生素高产菌株的选育， 特
１ ０ ］ 别是 在 链 霉 素 育 种 中。 Ｘ ｕ等 ［ 以始旋链霉菌（ Ｓ ．
进行融合， 在不加 Ａ ｒ ｇ 、 Ｌ ｅ ｕ 的培养基上筛选出融合子。 １ ． ３ ． ２ 利用抗药性标记筛选融合子 微生物的抗药 性是由遗传物质决定的， 不同种微生物对同种药物的 抗性存在差异， 利用这种差异即可对融合子进行筛选。 杨合同 等
Ｖ ｏ ｌ ． ３ ０Ｎ ｏ ． １２ ０ １ ０
常低， 因此在实际育种过程中要采用一定方法进行人 为诱导融合。在微生物原生质体融合中， 诱导融合方 Ｅ Ｇ结合高 Ｃ ａ 、 ｐ Ｈ 诱导 法主要有化学法（ 一般采用 Ｐ 法） 、 物理法（ 包括电融合和激光诱导融合法等） 。 当用 Ｐ Ｅ Ｇ法诱导原生质体融合时， 很多因素影响 Ｅ Ｇ聚合度、 Ｐ Ｅ Ｇ浓度和作用时间、 离子 融合频率。如 Ｐ 种类和浓度、 融合剂 ｐ Ｈ 、 温度等。一般来说相对分子 质量为 １０ ０ ０ ６０ ０ ０的 Ｐ Ｅ Ｇ都是有效的， Ｐ Ｅ Ｇ的浓度为 ３ ０ ％～ ５ ０ ％， 不同相对分子质量的 Ｐ Ｅ Ｇ溶液在相同质 量分数时是同效的。在融合过程中， 适量的 Ｃ ａ 、 Ｍ ｇ
后， 筛选出胞外葡萄糖氧化酶（ Ｇ Ｏ Ｄ ） 活性最高的突变 株进行融合， 得到的融合子 Ｃ １ ５ 、 Ｃ １ 、 Ｃ １ ８的 Ｇ Ｏ Ｄ活 性达到了 ６ １ ． ４Ｕ／ ｍ ｌ 、 ６ ０ ． ８Ｕ／ ｍ ｌ 、 ６ ２ ． ７Ｕ／ ｍ ｌ ， 较初始菌 分别提高了 ３ ８ ６ ． ２ ％、 ３ ８ ２ ． ４ ％、 ３ ９ ４ ． ３ ％。 原生质体融合技术在构建各种代谢物高产菌株方
［ ５ ］
ｐ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｎ ａ ｅ ｓ ｐ ｉ ｒ ａ ｌ ｉ ｓ ） Ｃ Ｇ Ｍ Ｃ Ｃ ０ ９ ５ ７突变菌中普纳霉素产量最 高的四株菌为亲本进行原生质体融合， 得到普纳霉素 ９ ． ４ ％， 达到 ０ ． ８ ９ｇ ／ Ｌ的优良菌株。 Ｊ ｉ ｎ 产量比亲本高 ８
１ １ ］ 等［ 以 １ ０株 产 量 较 高 的 多 杀 菌 素 产 生 菌
［ ６ ］
Ｓ ａ ｃ ｃ ｈ ａ ｒ ｏ ｐ ｏ ｌ ｙ ｓ ｐ ｏ ｒ ａｓ ｐ ｉ ｎ ｏ ｓ ａ 为出发菌株， 经过融合， 得到高 产菌株 Ｓ ．ｓ ｐ ｉ ｎ ｏ ｓ ａ４～ ７ ， 其产量可达到 ５ ４ ７ｍ ｇ ／ Ｌ ， 较出 发菌株 提 高 了 ２ ０ ０ ． ５ ５ ％ 以 上， 在 ５Ｌ发 酵 罐 中 发 酵 １ ６ ８ ｈ ， 多杀菌素产量可达到 ４ ２ ８ ｍ ｇ ／ Ｌ 。 在酶制剂产生菌的选育研究中， 原生质体融合技 术也应用广泛。主要用于提高菌种产酶活力。 Ｋ ｈ ａ ｔ ｔ ａ ｂ
酶解时间较短， 原生质体的再生率高。另外， 菌体的预 处理， 酶的处理温度， 渗透压稳定剂等都会影响微生物 原生质体的制备和再生。 １ ． ２ 原生质体的融合 由于在自然条件下， 原生质体发生融合的频率非
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中图分类号 Ｑ ９ ３ ３ 微生物菌种是发酵工业中的一个关键因素， 它决 定了发酵过程的成败及某一发酵产品是否具有工业化 价值。自然界中的原始菌株大多不具有很高的工业化 价值， 因此需要对菌株进行选育和改良， 以提高产品的 ０世纪 质量， 降低成本。原生质体融合技术是起源于 ２ ６ ０年代的一项重要的菌种改良技术， 是将亲株细胞分 别去除细胞壁后进行融合， 经基因组间的交换重组， 获
［ ４ ］
Ｅ ｘ ｓ ｅ ｒ ｏ ｈ ｉ ｌ ｕ ｍｍ ｏ ｎ ｏ ｃ ｅ ｒ ａ ｓ ）和 弯 孢 菌 （ Ｃ ｕ ｒ ｖ ｕ ｌ ａ ｒ ｉ ａ 孢菌 （ ｌ ｕ ｎ ａ ｔ ａ ） 融合实验中， 根据菌落形态及大小筛选出了孢 子产量高、 代谢产毒能力强的融合子。
以大肠杆菌
Ｅ ｓ ｃ ｈ ｅ ｒ ｉ ｃ ｈ ｉ ａｃ ｏ ｌ ｉ ） Ｗ４ １ ８ ３ （ Ａ ｒ ｇ ） 及Ｆ ｕ ２ ０ １ （ Ｌ ｅ ｕ ） 为亲本 （
８ ］ 来筛选融合子。袁耀武等 ［ 将能氧化邻苯二胺的酿酒
Ｓ ．ｃ ｅ ｒ ｅ ｖ ｉ ｓ ｉ ａ ｅ ） 及具有分解尿素能力的粟酒裂殖酵 酵母（ 母（ Ｓ ．ｐ ｏ ｍ ｂ ｅ ） 融合， 利用二者的生理特征进行显色反 应， 从而筛选融合子。 １ ． ３ ． ６ 利用其他标记筛选融合子 利用 Ｄ Ｎ Ａ水平上 的分子标记或 Ｄ Ｎ Ａ含量、 氨基酸含量等生化指标来选 择融合子， 对具有能直接观察的形态学差异的菌株也
９ ］ 在稗突脐蠕 可通过形态差异来选择融合子。赵航等 ［
加入， 融合就能较长时间地有效进行， 但由于 Ｐ Ｅ Ｇ有一 Ｅ Ｇ处理时间一般控 定的毒性， 因而大部分学者认为 Ｐ 制在 １～ １ ０ ｍ ｉ ｎ 即可。 １ ． ３ 融合子的筛选 １ ． ３ ． １ 利用营养缺陷型标记筛选融合子 融合双亲 为不同的营养缺陷型， 原生质体融合后于基本培养基 进行培养。由于双亲都丧失了合成某种物质的能力， 在基本培养基上不能生长， 而在融合子中， 缺陷的遗传 物质得到互补， 所以可在基本培养基上长出菌落， 利用 ａ ｉ 等 这 种 方 法 即 可 检 出 融 合 子。 Ｄ
１ ３ ］ 面的 应 用 也 十 分 普 遍。 Ｙ ｕ等 ［ 以鼠李糖乳杆菌
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（ Ｌ ａ ｃ ｔ ｏ ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｒ ｈ ａ ｍ ｎ ｏ ｓ ｕ ｓ ） Ｌ ｒ ＷＴ的 诱 变 优 良 菌 为 出 发 菌， 通过双 亲 灭 活， 用碳酸钙高糖平板筛选有效融合 ２ ２ ， 在 子， 得到具有耐糖和高产两个表型的改良菌株 Ｆ 初糖 浓 度 １ ５ ０ ｇ ／ Ｌ 发 酵 罐 中， Ｆ ２ ２的 乳 酸 产 量 为 １ ４ ０ ｇ ／ Ｌ ， 是野生菌的 １ ． ８倍。 ２ ． ２ 提高菌株降解能力 构建高效降解菌株， 将几种菌各自突出的降解性 能融合到一个菌株中， 用于降解污水及土壤中的有害 物质， 也是原生质体融合技术的一个重要应用。卢显
摘要 工 业 微 生 物 菌 种 选 育 在 发 酵 工 业 中 占 有 重 要 地 位。微 生 物 原 生 质 体 融 合 （ ｍ ｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ ａ ｌ ｐ ｒ ｏ ｔ ｏ ｐ ｌ ａ ｓ ｔ ｆ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎ ） 技术具有重组频率高、 受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整等优点， 是微生物育种最常用的方法之一。结合相关研究进展， 分析了原生质体融合技术的组成， 包括制 备、 再生、 融合的影响因素以及融合子的筛选方法， 重点评述了原生质体融合技术应用在微生物 育种中的最新进展， 以及微生物原生质体融合技术的发展前景。 关键词 微生物 原生质体融合 遗传育种 基因组重组
１ ］ 。与其他育种技术相比， 原生质体 得融合子的过程 ［
及其遗传标记选择， 双亲本原生质体制备和再生， 亲本 原生质体诱导融合， 融合重组体筛选， 遗传特性分析和
３ ］ 。 测定 ［
１ ． １ 原生质体的制备和再生 原生质体的制备首先要去除细胞壁， 当前去壁的 方法主要有机械法、 非酶法和酶法， 现在使用较多的为 酶法。在放线菌和细菌中， 主要采用溶菌酶， 酵母菌和 霉菌一般用蜗牛酶、 消解酶或纤维素酶等。影响原生 质体制备和再生的因素很多： 在菌龄上， 为了使细胞易 于原生质体化， 一般选择对数生长期或生长中期的菌 体， 也有的采用生长后期的菌。酶浓度以及作用时间 也会影响原生质体的制备和再生率， 一般来说酶浓度 越高， 作用时间越长， 原生质体制备率就越高， 但酶解 时间过长又会影响再生率。对于不同的菌体， 优化其 最适酶浓度和作用时间非常必要。本实验室在琥珀酸 放线杆菌（ Ａ ｃ ｔ ｉ ｎ ｏ ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｓ ｕ ｃ ｃ ｉ ｎ ｏ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ） 的原生质体制备 和再生实验中发现采用对数生长中期的菌更易于原生 质体化， 在酶解琥珀酸放线杆菌（ Ａ ．ｓ ｕ ｃ ｃ ｉ ｎ ｏ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ） 过程 中， 最适的酶浓度大大低于其他革兰氏阴性菌， 且最佳
１ 原生质体融合技术
原生质体融合技术一般分成五大步骤： 直接亲本
收稿日期： ２ ０ ０ ９ ０ ９ ０ ９ 修回日期： ２ ０ ０ ９ １ １ ０ ５ ８ ６ ３ ” 计划（ ２ ０ ０ ６ Ａ Ａ １ ０ ０ ２ ０ ５ ） 资助项目 国家“ 通讯作者， 电子信箱： ｚ ｂ ｈ ｕ ａ ｎ ｇ ２ ０ ０ ３ ＠１ ６ ３ ． ｃ ｏ ｍ
将带有抗苯菌灵标记的哈茨木霉菌株
Ｔ ｒ ｉ ｃ ｈ ｏ ｄ ｅ ｒ ｍ ａｈ ａ ｒ ｚ ｉ ａ ｎ ｕ ｍ ） Ｔ ９和带有潮霉素 Ｂ标记的康 （ 宁木霉菌株（ Ｔ ．ｋ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ ｉ ｉ ） Ｔ ｋ ７ ａ 进行原生质体融合， 用 得到带有两亲本 含有苯菌灵和潮霉素 Ｂ的平板筛选， 共同抗性的融合子。 １ ． ３ ． ３ 利用灭活标记筛选融合子 通过灭活标记筛 选融合子是指将单亲 或 双 亲 的 原 生 质 体 经 紫 外 线 照 射、 加热或经过某些化学药剂处理， 使其丧失在再生培 养基上再生的能力， 两亲株融合后， 融合子损伤互补， 因而可在再生培养基上存活。骆健美等