染色体制备

实验四染色体制备
【实验原理】
1. 每一物种的细胞一般都具有一定数目、形状和大小的染色体。

2. 在秋水仙素的作用下可使分裂细胞阻断在中期，此时染色体形态最典型，然后通过低渗、固定、染色等步骤，便可在显微镜下呈现出其形态。

【试剂、材料与仪器】
1. 试剂：生长培养基（添加10% 胎牛血清），0.25% 胰蛋白酶，0.2% EDTA，PBS，冰醋酸，甲醇，秋水仙碱，95%乙醇，HCl，Giemsa染液，双蒸水
2. 材料：细胞培养瓶，移液管（5 mL、10 mL），无菌离心管，载玻片，胶头滴管，染色缸等
3. 仪器：生化培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，低速离心机，切片烘干机，制冰机，水浴锅
【实验操作】
1. 细胞处理
①将细胞接种于2个T 75cm2培养瓶中生长约24 h，形成80%融合的单层细胞；
②弃去旧培养基，加入10 mL新鲜含10%血清的生长培养基和0.1 mL秋水仙碱溶液（1 μg/mL，PBS配制），25 ℃下继续培养13~15 h；
③用EDTA和胰蛋白酶消化收集细胞，1000 rpm/min离心5分钟；
④收集沉淀细胞，加 2 mL PBS 混匀细胞，移到T 75cm2 的培养瓶，慢慢加10 mL 预冷的双蒸水（4℃），室温孵育10 min；
⑤慢慢加入10 mL 固定液（现配的冰醋酸：甲醇= 1:3），室温放置10 min，移入离心管，1000 rpm /min离心10 min，弃上清，留约2 mL，再加入3 mL新鲜固定液，轻轻混匀，1000 rpm/min 离心5 min；弃上清，留约0.5 mL，再加入0.5 mL 新鲜固定液，轻轻混匀细胞, 然后加4 mL 新鲜固定液，轻轻混匀，室温放置5分钟，1000 rpm/min 离心5分钟；
⑥弃去4.8 mL上清，仅留0.2 mL，加1-1.5 mL新鲜固定液，轻轻混匀细胞沉淀。

2. 清洁载玻片和染色准备：
①取6-8个干净的载玻片，浸泡在95%乙醇里，烘干，浸泡在冰水里至少30 min；
②把装有1N HCl的染色缸，浸入60℃水浴中加热备用。

3. 滴玻和染色：
①用移液管吸取细胞悬液0.2mL，滴在湿载玻片上，火焰上拖动，固定2-3次；
②放在预热的切片烘干机上，15 min（蒸发液体）；
③把载玻片插入装有1N HCl的染色缸（60℃水浴中）孵育10min，取出载玻片，用双蒸水清洗玻片2次，空气干燥；
④将载玻片浸入Giemsa染液的染色缸中（现稀释1：25），孵育15 min，用双蒸水冲洗载玻片2-3次，除去残液，空气干燥，于显微镜（Motic BA400）下进行拍照和染色体计数。

【实验结果与讨论】
一共做了4片玻片，其中有3片可观察，具体情况如图。

实验结果不理想，可能在实验过程中动作不轻柔导致细胞破碎。

图8.1 图8.2
图8.3
【思考题】
1. 为什么制备染色体时，要加入秋水仙碱？
细胞有丝分裂中期染色体浓缩变粗，染色体排列在细胞板上，能清楚显示出该物种所特有的数目和形态，因此有丝分裂中期适于做染色体的形态、结构和数目的研究。

但是中期时间较短，加入秋水仙素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期，便于观察。

2. 制备染色体时，处理细胞时，步骤4中要加入预冷的双蒸水？
做低渗处理，使细胞膨胀但不至于破裂。