蛋白质的分离与提纯

蛋白质的理化性质
蛋白质的两性解离 蛋白质的胶体性质 分离基础 蛋白质的变性、沉淀和凝固 蛋白质的紫外吸收 鉴别和检验 蛋白质的呈色反应
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蛋白质的胶体性质
蛋白质在溶液中形成的颗粒直径大约1～100 nm，属于胶体颗粒的范围，所以蛋白质是 胶体物质，蛋白质的水溶液是亲水胶体溶液。 蛋白质形成亲水胶体溶液的稳定因素：分子 表面的水化层和电荷层。 蛋白质的水溶液是稳定的亲水胶体溶液。溶 液扩散慢，粘度大，不能透过半透膜。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
作用：用于分离蛋白质和寡核苷酸。 原理： 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有 两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶 、SDS-聚丙烯酰胺凝 胶（SDS-PAGE） 非变性聚丙烯酰胺凝胶：电泳过程中，蛋白质保持完 整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及 其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。 SDS-PAGE：仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分 开蛋白质。该技术最初于建立1967年，在样品介质和丙 烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚 基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽 略电荷因素）。
分步图解
第二步 SDS-PAGE电泳
将蛋白质样品加 入到仪器的第二 道或之后道中， 第一道为蛋白质 的分子量标准参 考列表
实际操作图示
成果图示
仪器分析
实验·流程图解
样品制备
调配丙烯酰胺单体溶液
制备聚丙酰胺凝胶
电泳
分离纯化成果
蛋白质的变性、沉淀和凝固
蛋白质的变性 蛋白质的沉淀：蛋白质分子凝聚而从溶液中 析出的现象。蛋白质变性后，疏水侧链暴露 在外，肽链相互缠绕，继而聚集，因而从溶 液中析出，产生沉淀。变性的蛋白质易于沉 淀；有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。 凝固是蛋白质变性后进一步发展的一种结果。
近20年，生物技术有了很大发展。但是，对于大多数生物 技术产品来说，必需经过分离纯化，即所谓后处理过程， 达到一定的质量标准后，才是可用产品。根据目前经验， 大多数生物技术产品的研究开发中，约40-80%的资金用 于后处理过程，而精细产品，基因工程产品比例更高。另 外，分离纯化技术不仅影响产品质量，在一定程度上也影 响着产量。分离纯化技术已成为生物技术领域中的关键技 术之一。利用遗传工程的方法对目的产物，主要是蛋白质 的组成予以改变或对某些部分加以修饰，使某些性质改变， 使之有利于分离纯化如利用遗传工程的方法，将凝聚因子 引入，使细胞在培养过程中凝聚，以便容易进行细胞分离
蛋白质的分离纯化 （SDS-PAGE电泳）
报告人：左圣升 韩东升 宋昊东
PART 1
化1003班 左圣升
蛋白质
蛋白质是由氨基酸组成的生物大分子，其理 化性质一部分与氨基酸相同或相似，如两性 电离、等电点、紫外吸收性质和呈色反应等； 也有一部分又不同于氨基酸，如高分子量、 胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点。
蛋白质的分离纯化方法
透析法
大分子的蛋白质不能通过半透膜而滞留在透析袋内；小 分子的物质可以自由进出透析袋，直到它在透析袋内外 的浓度相同，即达到平衡，而使大分子与小分子分开。
过滤法
利用不同孔径的介质，截留一定大小的颗粒。
层析法
以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相， 以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质
第一步：一维——根据所 带电荷不同将蛋白质混合 物样品分离为几组
分离纯化 整体流程
蛋白质样品
第二步：二维——将 每组带电量相同的不 同蛋白质，根据相对 分子质量不同，用 SDS-PAGE电泳进 一步分离
等电点聚焦分离 SDS-PAGE (根据所带电量) （根据相对分子质量）
分步图解
第 一 步
蛋白质移动到其特定的pI值位置，pI值相同 的蛋白质可用凝胶电泳进一步分离
强调Again：此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子 质量，而与所带电荷和分子形状无关。
要点补充
对蛋白质的分离可通过在各种凝胶中的电泳完成，聚丙酰胺凝胶最常用。凝胶通过 单体丙烯酰胺的聚合成链以及链的交联而形成的半固态模型，注入到一对玻璃板之间。 凝胶孔隙大小可通过调整聚丙烯酰胺和交联剂的浓度而改变。高交联=毛孔非常小。 这样的凝胶可通过小蛋白和多肽,但不能通过大的蛋白质。小分子蛋白质通过凝胶的 迁移速度比大分子蛋白质快。 凝胶的孔径和电场的强度影响运动速度。 蛋白质在进入凝胶电泳之前先暴露在离子洗涤剂SDS中。SDS将蛋白质用负电荷包 裹，被包裹的多肽链可以通过相对分子质量分离。 即使是相对分子质量相差不足10%的多肽链也可以分离！ 可通过比较未知蛋白质在凝胶中迁移的距离与与已知分子量的蛋白质在凝胶中迁移 距离来确定其相对分子质量。 SDS的作用消除了形状差异的影响 链的长度=蛋白质迁移速率的唯一决定因素
蛋白质的分离纯化方法
一、离心法
二、沉淀法
三、透析法
四、过滤法 五、层析法 六、电泳法
蛋白质的分离纯化方法
离心法
借助离心力场，根据分子不同的大小、形状和质量在离 心场中表现出不同的行为而达到相互分离的目的。
沉淀法
基本原理：根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到 分离的目的。溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及 结构有关。 主要方法： 1. 等电点沉淀法2. 盐析沉淀法3. 有机溶 剂沉淀法4. 蛋白质沉淀剂
电泳法
离心法
离心法
+
=
返回
沉淀法
返回
透析法
返回
过滤法
返回
层析法
返回
电泳法
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PART 3
Part 3：SDS-PAGE电泳
化1003班 宋昊东
？
何为SDS-PAGE电泳法？？
sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠 polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳
前景
前 景
机械破碎法 材料的预处理 及细胞破碎
蛋白质的提取
渗透破碎法
酶法
一般程序 蛋白质粗制品 的获得 样品的进一步 分离与纯化
等电点沉淀法 盐析法 有机溶剂沉淀 法
蛋白质的分离与纯化方法简介
PART 2
化wk.baidu.com003 韩东升
蛋白质的分离与纯化
（一） 蛋白质的理化性质
（二） 分离纯化蛋白质的方法
过程详解
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，能断裂分子内和分子间 氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂能使 半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后， 分子被解聚成多肽链，氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的 负电荷大大超过了蛋白原有电荷量，消除了不同分子间的电荷差异和结 构差异。 凝胶有堆积作用，浓度较小，孔径较大，较稀的样品经过大孔径凝胶的 迁移作用被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲 液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解 离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，一起向正极移动。电泳开 始时氯离子泳动率最大，在后面形成低电导区，产生较高的电场强度， 使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移 动界面附近，浓缩成一中间层。 SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，有较高的分辨率。
蛋白质分离纯化 意义
蛋白质和酶在生物体内催化代谢反应、物质运转、运 动的 相互协调、兴奋的传导、生长与发育的控制等 过程中都起重要的作用。因此，研究蛋白质对了解生 命规律、指导工业生产、医药实践有着重大的理论与 实践意义，而蛋白质的分离与纯化是蛋白质研究中必 不可少的一个环节，必须要了解目的蛋白的分子量、 等电点、溶解性及稳定性等基本性质才能制定由合理 的分离纯化方法。