鸡胚培养法

鸡胚培养法（病毒分离培养）

鸡胚是发育的机体，适合许多人类和动物病毒及立克次体的生长增值，常用于痘类病毒、粘液病毒、和疱疹病毒的分离、鉴定、抗原准备、疫苗生产以及病毒性质等方面的研究。鸡胚培养病毒，常用的接种途径包括绒毛尿囊膜，尿囊腔、羊膜腔以及卵黄囊接种四种。根据不同病毒，不同实验目的以及不同来源的标本，选择不同的途径接种鸡胚进行培养，即可达到分离培养病毒和传代病毒的目的。本片主要介绍尿囊腔和羊膜腔两种接种途径在病毒分离培养和传代中的应用。

鸡胚的接种方法、孵育及收获

一、仪器和器材

SPF鸡卵或鸡胚、二级生物安全柜、孵卵箱或恒温箱、检卵灯、照蛋灯、开卵钻、卵盘、1ml、1次注射器、医用胶布、液体石蜡、无菌镊子、巴氏吸管、15 ml无菌离心管、试管架、96孔微量反应板、加样槽、移液器、75%酒精、生理盐水等。

二、鸡胚的孵育

应选择保存温度在100左右，时间不超过10天，卵壳薄而色浅的鸡卵，用于鸡胚的孵育。特别脏的鸡卵需用清水清洗，用布擦干后孵育，干净的鸡卵不必做任何处理。将鸡卵置于380C---390C孵卵箱，在孵卵箱底层盛水器中放入干净自来水，以保证鸡胚发育的湿度，病保持良好的通风，孵育至第四天，于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。受精鸡卵可见清晰地血管小团和发育的鸡胚迹象，似蜘蛛壮，未受精鸡卵仅能看见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。在孵育过程中，应随时对鸡胚进行检查，淘汰濒死或已经死亡的鸡胚。若在恒温箱里孵育鸡胚，则应在恒温箱底层放入装满水的广口容器，并从孵育的第3天起，每天180度转到鸡胚1—2次，是鸡胚发育匀称。也可直接订购孵育9—11日龄的鸡胚。

如何判断鸡胚存活状态：1胎动：于检卵灯下可见活胎有明显的自然运动，但胎龄大于14天的胚胎，胎动不明显，甚至无胎动，死胎则无任何胎动，胎发红似出血样，有的呈现黑快。2血管：活胚可见清晰地血管，卵壳较薄者还可见血管的搏动。死胎血管模糊，成淤血带或淤血块。3绒毛尿囊膜发育界限：生活良好的胚胎可见密布血管的绒毛尿囊膜，与胚胎的另一面形成良好的界限须将上面三个方面结合起来进行观察，如果胚胎活动呆滞或不能主动地运动，血管模糊扩张，或折断沉落，绒毛尿囊界限模糊，则可判断胚胎濒死或已经死亡。

三、鸡胚接种（尿囊腔）

（一）尿囊腔接种：一般应用于流感病毒、新城鸡瘟病毒和腮腺炎病毒的适应、传代和病毒量的扩增。病毒在尿囊的内胚层细胞中繁殖，并释放到尿液中，因此，在尿囊液中含有大量病毒，可用血凝实验来测定病毒的存在。1.接种方法及步骤：选择发育良好的9—11日龄鸡胚，用于尿囊腔接种，在检卵器上画出鸡胚的气室边界及胎位，在胚胎面与气室交界边缘约1mm处避开血管做一标记。此即为注射点，用酒精消毒，用开卵钻在注射点部位开一个约2mm的小孔，勿损伤壳膜，用注射器注入：

0.1---0.2ml接种物，用医用胶布将小孔封好，气室朝上置于卵架，放入330C---350C

孵卵箱进行培养，孵育24小时后检视，弃去死胎，2收获：收获时间依据不同病毒而异，一般培养36—48小时可进行收获。收获前，将鸡胚置于40C冰箱6小时或过夜，如实验急需进行，可置-200C冰箱半小时至1小时左右，目的是避免收获时流出的血细胞，同尿液或羊水里的病毒发生凝集造成病毒滴度下降。经冰冻的鸡胚即可用酒精消毒气室部位卵壳，用镊子除去气室卵壳及壳膜，注意勿使卵壳碎片落在未损伤的壳膜上，撕破绒毛尿囊膜，用巴氏吸管轻插于尿囊腔中，缓慢吸取尿囊液于无菌试管内并作无菌实验，此步操作应特别注意避开血管，不要刺破卵黄囊，一个鸡胚可收获6ml左右清量微黄的尿囊液，最多可达10ml，

（二）羊膜腔接种：羊膜腔接种主要应用于从临床材料中分离病毒，如从患者咽樕液中分离流感病毒，接种到羊膜腔的病毒，可使全胚胎感染，病毒被排泄入尿囊腔，在尿囊液中含有大量病毒，因此，羊膜腔接种分离病毒时，除收获羊水外，还应收获尿囊液。1.接种方法及步骤：选择发育良好的10—12日龄鸡胚，经照视后，标出气室边缘和胚胎位置，将鸡胚气室朝上置于卵架上，消毒后在气室靠近胚胎侧的卵壳上，钻一个约（10*6mm）的小孔，用镊子除去卵壳及外层壳膜，滴入无菌液体石蜡，轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在壳膜内层铺开，此时在照射灯下可清楚地看到鸡胚胎的位置。当注射器针头进入羊膜腔后，见鸡胚随针头波动而动，即可注射0.1---0.2ml 接种物，每个标本接种3—4个鸡胚，接种完毕后，用医用胶布将小孔封好，330C---350C孵卵箱直立孵育，孵育24小时后检视，弃去死胎。2收获：收获前将鸡胚同尿囊腔接种一样冻死，消毒气室部位的卵壳，将气室界限以上的卵壳打碎，用镊子除去气室部卵壳及壳膜，注意勿使卵壳碎片落在未损伤的壳膜上，撕破绒毛尿囊膜，用巴氏吸管吸出尿囊液，然后左手持小镊夹起羊膜成伞状，右手用巴氏吸管插入羊膜腔吸取羊水，一般可获得0.5—1.0 ml羊水，如羊水过少，可用少量灭菌生理盐水冲洗羊膜腔吸取洗液，收获的病毒液，置消毒容器中，低温保存备用。为增加标本中病毒的检出率，可采用双腔法进行接种，即在羊膜腔接种0.1ml标本液后，将针头退出至二分之一寸，将另外0.1ml标本液注入鸡胚尿囊腔，此后的操作同上，四、病毒的检测：

检测鸡胚内病毒繁殖有直接和间接两种方法

直接方法包括：绒毛尿囊膜形成豆疱，鸡胚死亡，鸡胚特殊损害和鸡胚生长迟缓等

间接方法：是用第2个指示系统，列如血凝实验或补体结合实验，检测病毒所用方法根据病毒对宿主细胞的作用而选择。

用流感病毒、腮腺炎病毒接种尿囊腔和羊膜腔，查不到直接感染的指标。因此只能用第二个指示系统，列如：流感病毒可以通过对羊水或尿液进行血凝实验测定病毒的存在，腮腺炎病毒可用被感染的鸡胚的液体或组织与特异免疫血清做补体结合实验测定病毒的存在，也可对受染鸡胚器官做病理检查，如狂犬病毒注入鸡胚脑中，可以在脑组织中产生特异性病变，如：包涵体，

注意事项：1、在鸡胚孵育过程中，应随时注意保持孵箱中广口容器有足够的水，以保障鸡胚生长所需要的湿度。

2鸡胚收获前放冰箱的时间不能过长，否则会导致散黄，影响收获，或鸡胚冻成冰块无法收获。

3严格无菌操作，以减少污染率，在满足实验目的的前提下，接种方法越简单越好。

4．接种病毒后的鸡胚，应根据所分离培养病毒繁殖所需要的温度和时间置温箱培养，一般温度为：33--370C

5、试验中所有用过的器具均应放入消毒容器中，待实验结束后统一处理，收获病毒液的鸡胚在生物安全柜内装入密封袋，然后进行高压处理。