第十六章细胞因子与细胞粘附因子的测定
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第十六章
细胞因子与细胞粘附因子的 测定
第一节 生物学测定方法 一、促进细胞增殖和抑制细胞增殖测定法 二、细胞毒活性测定法 三、抗病毒活性测定法 四、趋化活性测定法 五、生物学活性测定方法学评价 第二节 免疫测定方法 一、ELISA方法 二、流式细胞分析法 三、酶联免疫斑点试验 四、免疫学测定方法学评价
细胞病变效应(CPE)、 抑制病毒蚀斑形成或抑制病毒的产量 本法常用于IFN等的测定，IFN可诱导细胞产生抑制病毒 RNA和DNA合成的酶，保护细胞不受病毒感染，产生细胞病 变效应（CPE）。
细胞病变抑制法结果判断举例*
细胞病变程度分为5个等 级，即：
“0”，表示无明显CPE； “1+”，CPE≤25％； “2+”，CPE为25～50％； “3+”，CPE为50～75％； “4+”，CPE为75～100％。 根据病变程度找出CPEI50的标 本稀释范围，并以此计算出距 离比例和确定IFN效价。 该法操作复杂、影响因素较 多，在试验前应对所用的病毒 进行滴定。
第一节 生物学测定方法
生物学测定法分类
1.基于DNA检测的分子生物学测定法：
DNA扩增法 RNA印迹法
原ຫໍສະໝຸດ Baidu杂交法
核酸酶保护分析
2.生物活性测定法
生物活性测定法原理
根据细胞因子特定的生物学活性,应用相应的指示
系统,同时与标准品对比测定,从而得知样品中细
胞因子的活性水平,一般以活性单位(U/ml)表示
刺激细胞增殖或集落形成的活性 有助于细胞因子 检测的活性作用 维持细胞生长和存活的特性 抑制细胞生长或破坏细胞的效应 促进细胞趋化或抗病毒作用
一、促进细胞增殖和增殖抑制测定法
以细胞因子依赖性细胞株为靶向，通过观 察特定的细胞因子刺激或抑制依赖性细胞
株增殖来评估细胞因子的活性水平。
细胞增殖检测方法分类
加入MTT前温育时间（h）
96/48 96 96 72 120
检测细胞因子
IL-6 IL-11 IL-13
TGF-β
WEHI-164/clone13
32D/Mp110S L929 CTLL-2 小鼠基质细胞, 32DCL-27
2×103
1×103 2×105 105 1.5×105
72
44 56 22-24 72
情况可用同位素51Cr释放法判断，或应用台盼兰染色死细胞后直接计数。也可
通过结晶紫、萘酚蓝黑、MTT、NBB等着染活细胞，再用脱色液脱出染料后酶标 仪比色测定吸光值。死细胞数、51Cr释放量越高或比色测定的吸光值越低，表
明待测细胞因子的细胞毒活性则越高。应用系列稀释的细胞因子标准品，制作
其活性与剂量关系的标准曲线，以此作为待测品活性的定量测定的基础。
与同位素掺入法相比
测定步骤类似
掺入物：MTT而非3H-TdR； 反应条件：选用的细胞及其浓度、 培养时间不同
细胞增殖或抑制活性检测的MTT比色法常用靶细胞
细胞株/原代细胞
B9，MH60,BSF2,TTD1 B9-11 B9-1-3 KYM-1D4 MV-3D9
细胞终浓度（细胞数/ml）
5×104/2×105 5×104 5×104 2×103 5×103
直接计数法 简便、直观,但费时、主观因素影响大、难 以标准化和自动化 细胞代谢活性测定方法 3H-TdR、125I-UdR掺入法或MTT等比色法 细胞代谢产物测定法 代谢产物荧光强度测定法和指示细胞表面标 记或可溶性分子测定法
(1) 放射性核素掺入法
通过检测细胞DNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。在
本法常用于TNF等的测定
三、抗病毒活性测定法
常用于检测抗病毒活性的细胞株
Wish、Hep2/c 人干扰素 L929 小鼠干扰素 Ratec 大鼠干扰素 A549 MDBK 多种族的IFN-α和IFN-γ
常用于攻击细胞的病毒 检测抗病毒活性的方法
VSV、EMCV及Sindbis virus等
细 胞 株
D10G4.1 L929 CTLL-2
FDC-P1,32DCL-27
所需浓度（细胞数/ml）
2×105 2×105 105 5×104
3H-TdR前培养时间
3H-TdR后培养时间
检测细胞因子
IL-1 IL-1 IL-2 IL-3
48 56 24 24
18-20 16 4-6 4-8
CT.4S
IL-4
IL-5 IL-5 IL-5 IL-5 IL-7 IL-9 IL-11 SCF （干细胞因子） TGF-β GM-CSF M-CSF/G-CSF
TS1 T10 UT-7 CCL-64* DA3.15, IF M14/NES60.4
(2) MTT 比色法
特点：不使用放射性核素， 以细胞代谢变化为增殖指征 指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关
细胞的增殖过程中，DNA合成的增加使得指示细胞对核苷或碱基的需
求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素（ 3H/125I ），通过检测 细胞内的同位素含量，则可反映细胞增殖的程度。
结果客观易于自动化； 适用于大标本量的测定
方法的特异性受依赖细胞 株影响；放射性污染
常见细胞因子3H-TdR掺入检测法所需细胞及参考试验条件
TNF
TNF IL-2 IL-3
二、细胞毒活性测定法
对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细胞共育将会导致细胞死亡。
基 本 原 理
因此，待测细胞因子作一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞
的死细胞数作为判断指标，死细胞数量与细胞因子的活性呈正比。试验时，与 细胞增殖或抑制方法一样，以已知活性的细胞因子标准品为对照。死、活细胞
CH12 B13 T88-M BCL1
Clone-K,I×N/2bx
105
5×103 5×104 1×105 105 105 3×104 105 1.5×105 5×108 5×104 5×104
24
48 36 24 72 24 66 72 72 72 24 24
4-6
6 12 12 6 4-6 6 6 6 8 4-8 4-8
第三节
细胞因子与细胞粘附分子测定的临床应用
一、临床应用原则
二、特定疾病诊断的辅助指标 三、评估机体的免疫状态、判断治疗效果及预后
思考题 小结
细胞因子
是由活化的免疫细胞及某些基质细胞表达并分泌
的活性物质，其主要生物学功能是介导和调节免疫
应答及炎症反应，其化学本质是蛋白质或多肽。
细胞粘附因子
是介导细胞间及细胞与细胞外基质间粘附作用 的分子，其化学本质为糖蛋白，可以细胞膜表面表 达和可溶性两种形式存在。
细胞因子与细胞粘附因子的 测定
第一节 生物学测定方法 一、促进细胞增殖和抑制细胞增殖测定法 二、细胞毒活性测定法 三、抗病毒活性测定法 四、趋化活性测定法 五、生物学活性测定方法学评价 第二节 免疫测定方法 一、ELISA方法 二、流式细胞分析法 三、酶联免疫斑点试验 四、免疫学测定方法学评价
细胞病变效应(CPE)、 抑制病毒蚀斑形成或抑制病毒的产量 本法常用于IFN等的测定，IFN可诱导细胞产生抑制病毒 RNA和DNA合成的酶，保护细胞不受病毒感染，产生细胞病 变效应（CPE）。
细胞病变抑制法结果判断举例*
细胞病变程度分为5个等 级，即：
“0”，表示无明显CPE； “1+”，CPE≤25％； “2+”，CPE为25～50％； “3+”，CPE为50～75％； “4+”，CPE为75～100％。 根据病变程度找出CPEI50的标 本稀释范围，并以此计算出距 离比例和确定IFN效价。 该法操作复杂、影响因素较 多，在试验前应对所用的病毒 进行滴定。
第一节 生物学测定方法
生物学测定法分类
1.基于DNA检测的分子生物学测定法：
DNA扩增法 RNA印迹法
原ຫໍສະໝຸດ Baidu杂交法
核酸酶保护分析
2.生物活性测定法
生物活性测定法原理
根据细胞因子特定的生物学活性,应用相应的指示
系统,同时与标准品对比测定,从而得知样品中细
胞因子的活性水平,一般以活性单位(U/ml)表示
刺激细胞增殖或集落形成的活性 有助于细胞因子 检测的活性作用 维持细胞生长和存活的特性 抑制细胞生长或破坏细胞的效应 促进细胞趋化或抗病毒作用
一、促进细胞增殖和增殖抑制测定法
以细胞因子依赖性细胞株为靶向，通过观 察特定的细胞因子刺激或抑制依赖性细胞
株增殖来评估细胞因子的活性水平。
细胞增殖检测方法分类
加入MTT前温育时间（h）
96/48 96 96 72 120
检测细胞因子
IL-6 IL-11 IL-13
TGF-β
WEHI-164/clone13
32D/Mp110S L929 CTLL-2 小鼠基质细胞, 32DCL-27
2×103
1×103 2×105 105 1.5×105
72
44 56 22-24 72
情况可用同位素51Cr释放法判断，或应用台盼兰染色死细胞后直接计数。也可
通过结晶紫、萘酚蓝黑、MTT、NBB等着染活细胞，再用脱色液脱出染料后酶标 仪比色测定吸光值。死细胞数、51Cr释放量越高或比色测定的吸光值越低，表
明待测细胞因子的细胞毒活性则越高。应用系列稀释的细胞因子标准品，制作
其活性与剂量关系的标准曲线，以此作为待测品活性的定量测定的基础。
与同位素掺入法相比
测定步骤类似
掺入物：MTT而非3H-TdR； 反应条件：选用的细胞及其浓度、 培养时间不同
细胞增殖或抑制活性检测的MTT比色法常用靶细胞
细胞株/原代细胞
B9，MH60,BSF2,TTD1 B9-11 B9-1-3 KYM-1D4 MV-3D9
细胞终浓度（细胞数/ml）
5×104/2×105 5×104 5×104 2×103 5×103
直接计数法 简便、直观,但费时、主观因素影响大、难 以标准化和自动化 细胞代谢活性测定方法 3H-TdR、125I-UdR掺入法或MTT等比色法 细胞代谢产物测定法 代谢产物荧光强度测定法和指示细胞表面标 记或可溶性分子测定法
(1) 放射性核素掺入法
通过检测细胞DNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。在
本法常用于TNF等的测定
三、抗病毒活性测定法
常用于检测抗病毒活性的细胞株
Wish、Hep2/c 人干扰素 L929 小鼠干扰素 Ratec 大鼠干扰素 A549 MDBK 多种族的IFN-α和IFN-γ
常用于攻击细胞的病毒 检测抗病毒活性的方法
VSV、EMCV及Sindbis virus等
细 胞 株
D10G4.1 L929 CTLL-2
FDC-P1,32DCL-27
所需浓度（细胞数/ml）
2×105 2×105 105 5×104
3H-TdR前培养时间
3H-TdR后培养时间
检测细胞因子
IL-1 IL-1 IL-2 IL-3
48 56 24 24
18-20 16 4-6 4-8
CT.4S
IL-4
IL-5 IL-5 IL-5 IL-5 IL-7 IL-9 IL-11 SCF （干细胞因子） TGF-β GM-CSF M-CSF/G-CSF
TS1 T10 UT-7 CCL-64* DA3.15, IF M14/NES60.4
(2) MTT 比色法
特点：不使用放射性核素， 以细胞代谢变化为增殖指征 指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关
细胞的增殖过程中，DNA合成的增加使得指示细胞对核苷或碱基的需
求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素（ 3H/125I ），通过检测 细胞内的同位素含量，则可反映细胞增殖的程度。
结果客观易于自动化； 适用于大标本量的测定
方法的特异性受依赖细胞 株影响；放射性污染
常见细胞因子3H-TdR掺入检测法所需细胞及参考试验条件
TNF
TNF IL-2 IL-3
二、细胞毒活性测定法
对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细胞共育将会导致细胞死亡。
基 本 原 理
因此，待测细胞因子作一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞
的死细胞数作为判断指标，死细胞数量与细胞因子的活性呈正比。试验时，与 细胞增殖或抑制方法一样，以已知活性的细胞因子标准品为对照。死、活细胞
CH12 B13 T88-M BCL1
Clone-K,I×N/2bx
105
5×103 5×104 1×105 105 105 3×104 105 1.5×105 5×108 5×104 5×104
24
48 36 24 72 24 66 72 72 72 24 24
4-6
6 12 12 6 4-6 6 6 6 8 4-8 4-8
第三节
细胞因子与细胞粘附分子测定的临床应用
一、临床应用原则
二、特定疾病诊断的辅助指标 三、评估机体的免疫状态、判断治疗效果及预后
思考题 小结
细胞因子
是由活化的免疫细胞及某些基质细胞表达并分泌
的活性物质，其主要生物学功能是介导和调节免疫
应答及炎症反应，其化学本质是蛋白质或多肽。
细胞粘附因子
是介导细胞间及细胞与细胞外基质间粘附作用 的分子，其化学本质为糖蛋白，可以细胞膜表面表 达和可溶性两种形式存在。