第三章+双向电泳技术修改版
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Chapter III
Separation of Proteins
一、蛋白质电泳相关基本知识 二、双向电泳
1、2-DE 常见问题及解决方法 2、对角线电泳SDS-PAGE/SDS-PAGE 3、Native-PAGE/SDS-PAGE
三、2D-LC
一、蛋白质电泳相关基本知识
1、电泳
2、聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 3、等电聚焦电泳 4、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 5、蛋白质的检测－显色剂
基于凝胶中的固相pH梯度。这些具有弱酸或弱碱性质 的丙烯酰胺衍生物共价结合到聚丙烯酰胺凝胶介质形成 pH梯度后，带电的蛋白质分子便开始向自己的等电点 位臵迁移，直到到达自己的等电点。
等电聚焦中应注意的事项
1. pH梯度的选择。先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预 试验确定。 2.IEF如在宽pH范围载体两性电解质内进行，为了克服在中性区 域形成纯水区带，可适当添加中性载体两性电解质。 3.为防止电泳过程中pH梯度的衰变，一般电流降低达最小而恒 定时尽快结束IEF。 4.pH梯度(pI)测定: ①Rotofer制备电泳可分管测定收集液的pH 值；②凝胶IEF后，可分段切割凝胶，用3—5倍体积的蒸馏水 或10mmol KCl浸泡该凝胶，从凝胶浸出液中测定pH值，或 用微电极直接测定凝胶表面pH值；③薄层等电聚焦后，可用 微电极检测凝胶表面pH值根据蛋白质分布的pH值即能确定该 蛋白质的pI。 5.IEF聚焦过程中由于蛋白质泳动到某一区段，而该区段刚好是 该蛋白质的pI，造成蛋白质的沉淀出现絮凝现象，为了解决 此问题，可在样品中添加硫脲、TritonX－100、NP—40或其 他一些非离子型表面活性剂。
固相pH梯度等电聚焦（IPG IEF）
固相pH梯度的介质 Immobilines（固相试剂）是一系列性质稳定的具有弱 酸弱碱性质的丙烯酰胺衍生物，与丙烯酰胺和甲叉双丙 烯酰胺有类似的聚合行为。每个分子都有一个单一的酸 性或碱性缓冲基团与丙烯酰胺单连。 其结构式为：
其中R代表羧基或第三氨基
固相pH梯度的建立
1.电泳
电泳：带电粒子在电场中的定向移动。
V:泳动速度cm/秒or分 d:泳动距离cm t:电泳时间 (秒/分) E:电场强度 伏特/cm
u:泳动率or泳动度(cm/伏· 秒or分) U:电压 常压(100—500v) 高压(500—10000v)仅需几分钟 l:支持场的长度 (有效长度)
电泳类型 ⑴区带电泳 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、 细丝电泳、凝胶电泳。 凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅 胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳包括：垂直板、盘状、 等电聚焦、梯度、免疫电泳 ⑵自由界面电泳 支持物为溶液，很少用。
部分而建立pH梯度（线性和非线性），分辨率比前者高 一个数量级。 在凝胶聚合时形成pH梯度
载体两性电解质合成的历史即等电聚焦技术发展的历史
1912年 两个日本科学家在一个用膜隔开的，并在阳-阴极之间按pI 值的增加排列起来的三个腔的电解槽中将蛋白水解成氨基酸。 1929年 Willians设计成多槽，减少了扩散和对流，以提高分辨率。 1948年 Svensson对此作了综述。 50 年代 Kolin提出：聚焦离子应为一个pH梯度，用蔗糖密度梯度来 稳定，并定名为“等电谱”：在一个Tiselius似的装臵中，把被分离 的物质放到酸性和碱性缓冲液中间的内界面处，通电后，利用两个 不同pH的缓冲液互相扩散平衡，在其混合区形成人工pH梯度。 1961年 Svensson提出了载体两性电解质（CA）的概念。 1964年 Vesterberg成功合成了载体两性电解质，从此开创了高分 辨率电泳技术的新阶段。
Hale Waihona Puke Problems with traditional 1st dimension IEF
Works well for native protein, not good for denaturing proteins, because:
OPERATOR DEPENDENT
1.Takes longer time to run. 2.Techniques are cumbersome. (the soft, thin, long gel rods needs excellent experiment technique) 3.Batch to batch variation of carrier ampholytes. 4.Patterns are not reproducible enough. 5.Lost of most basic proteins and some acidic protein.
1937年，瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电泳 仪，建立了移界电泳法，开创了电泳技术的新纪元。
获1948年诺 贝尔奖
70年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色
三个技术环节，不断改进，以实现下列目标：
1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。
各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。
浓缩效应--聚焦
等电聚焦的分辨率（用两个邻近带的pI差△pI来表示）
pH梯度 蛋白质迁移率的斜率
蛋白的扩散系数
场强
D和du∕d(pH)是常数，所以只有通过提高场强和使 用窄pH范围来提高分辨率。但是电压过高产生的热 会使蛋白质变性甚至烧胶，所以场强的提高受到一 定的限制。 在窄的pH范围，分辨率会明显的提高。大多数情况 下，使用载体两性电解质的等电聚焦技术可将等电 点相差0.01-0.02pH单位的蛋白质分开。使用窄的pH 范围时，甚至可达到0.0025pH和0.001pH。
等电聚焦电泳电泳时间越长，蛋白质聚焦的区带就越集中，越狭窄， 因而提高了分辨率。这是等电聚焦的一大优点，不像一般的其他电泳， 电泳时间过长则区带扩散。
载体两性电解质的缺点
（1）由于合成载体两性电解质（SCA）是通过复杂的合成过 程得到的，其重复性很难控制，由此不同批次之间会存 在很大的变化，同一点蛋白质在不同批次等电聚焦中所 出现的位臵有所偏差，这样作为双向电泳中的一向时就 限制了蛋白质分离的重复性。 （2）SCA分子量相对较小，难以在IEF胶内固定，在等电聚焦 过程中由于水合正离子引起电渗流将致使SCA分子向负 极迁移（负极漂移），结果使pH值的不稳定性增加。 （3）负极漂移作用对碱性区蛋白质的影响尤其重要，结果常 导致碱性区蛋白质难以成功聚焦甚至导致碱性区蛋白质 的丢失。 （4）每一次灌制SCA凝胶的重复性难以控制，而且这种凝胶 的机械稳定性差，易拉伸变形或断裂，同样导致重复性 的降低。
蛋白质的等电点（pI）：当某蛋白质在一定的pH的溶 液中，所带的正负电荷相等，它在电场中既不向阳极 也不向阴极移动，此时溶液的pH值叫做该蛋白质的等 电点。 取决于其氨基酸的组成，是一个物理化学常数。 蛋白质的带电性质与溶液的pH有关 不同Pr其aa的数量、种类及占比例不同，pI不同
基本原理：利用蛋白质分子或其他两性分子等电 点的不同，在一个稳定的、连续的、线性的（或 非线性）pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。
这些科学家的努力为等电聚焦技术奠定了理论的和实践的基础。
载体两性电解质pH梯度等电聚焦：在支持介质中放入载体两 性电解质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有 两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴 定的目的。
载体两性电解质（CA）应具备的条件
(1)在等电点处必需有足够的缓冲能力，以便能控制pH梯度,而 不致被样品蛋白质或其他两性物质的缓冲能力而改变pH梯度 的进程。 (2)在等电点必需有足够高的电导，以便使一定的电流通过，而 且要求具备不同pH值的载体有相同的电导系数，使整个体系 中的电导均匀；如果有局部电导过小，就会产生极大的电位 降，从而其他部分电压就会太小，以致不能保持梯度，也不 能使应聚焦的成分进行电迁移，达到聚焦。 (3)分子量要小，便于与被分离的高分子物质用透析或凝胶过滤 法分开。 (4)化学组成应不同于被分离物质，不干扰测定。 (5)应不与分离物质反应或使之变性。 常用的载体两性电解质为多氨基多羧酸的脂肪族化合物， 分子量为300-1000，是由多乙烯多胺和丙烯酸加合而成。
载体两性电解质在电场中形成pH梯度的模式图
载体两性电解质分离原理
在支持介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性 电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的线性的pH梯度（预电 泳）。当蛋白质放进此体系时，靠近阳极侧的蛋白质处于酸性环 境中，带正电荷向负极移动；靠近阴极的蛋白质处于碱性环境中， 带负电荷向正极移动，最终都聚焦于与其等电点相当的pH位臵上， 形成不同的蛋白质区带。IEF样品可臵于任何位臵。
三种物理效应
⑴样品浓缩效应:由凝胶系统的不连续性产生 ⑵分子筛效应 ⑶电荷效应
电泳仪器
⑴垂直板电泳仪
⑵圆盘电泳仪
夹心垂直板电泳槽示意图
3.等电聚焦电泳 (Isoelectro focusing IEF or EF)
1966年瑞典科学家Rible和Vesterberg建立 分辨pI只差0.001pH单位的生物分子
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳 (polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)
单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺 (N,N-methylene-bisacylamide,简称Bis) 加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED) 催化剂过硫酸铵(简称AP) 核黄素(ribofavin即vita min B2,C17H2O6N4)
载体两性电解质pH梯度的形成
CA是两性分子,在凝胶聚合时形成两性分子在电场中,CA迁 移到自己的pI而形成pH梯度. 产生pH梯度的方法有两种： ①用两种不同pH的缓冲液互相扩散，在混合区形成pH梯度。 人工pH梯度，不稳定，且重复性差，现已不使用。 ②利用CA在电场作用下自然形成pH梯度，即天然pH梯度。 常用。
根据一定的计算后，把两种不同pK值的Immobilines 贮液按重力梯度混合，分别为相对酸性和碱性的丙烯酰胺 衍生物缓冲液的混合物，两种溶液中不同缓冲液的浓度决 定了所形成的pH梯度的范围和形状。两种溶液都含有丙烯 酰胺单体和催化剂，在聚合过程中，缓冲液中的丙烯酰胺 单体和甲叉双丙烯酰胺单体聚合，形成聚丙烯酰胺凝胶， 缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中，形成 pH梯度。
4.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（1967年 Shapiro）
原理 蛋白质样品在100℃用SDS和还原剂处理解聚成亚基 各种SDS-Pr均带相同密度的负电荷，其荷电超过了原Pr， 消除了不同Pr荷电差异。 加入SDS，改变了Pr的构象，SDS-Pr为长椭圆棒，各种短 轴约为1.8nm。
5.蛋白质的检测－显色剂
理想显色剂的7S 安全（safety） 灵敏（sensitivity） 简单（simplicity） 特异性（specificity） 快速（speed） 稳定（stability） 兼容性（synergy）
有机染料和银染
考染灵敏度为30－100ng，线性范围是20倍；银染的线 性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。 胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的无背景染色， 其极限灵敏度为8－10ng，但这种染液会对蛋白质进行 修饰而影响质谱分析的结果。 胺基黑常用于转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）和/或硝酸 纤维素膜上的蛋白质的染色。 银染的缺点是：对某些种类的蛋白质染色效果差，对其 后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。 这两种染色技术都可减少胶内蛋白质产量。
pH梯度建立
等电聚焦技术的关键
载体两性电解质pH梯度(Carrier ampholytes pH gradients，
CA):在电场中通过两性缓冲离子建立的pH梯度(线性)(共
电泳)。
固相pH梯度(1975年)（immobilized pH gradients，
IPG） 将缓冲基团共价键合在介质上成为凝胶介质的一
固定干胶条（immobiline pH gradients, IPG）的概 念：胶条由基质和聚丙稀酰胺形成一个整体，pH梯度的 产生是由酸性和碱性基团与聚丙稀酰胺以梯度式共价键 连接而形成。即使在电场中，它也是“固相”的。
Schematic drawing of a IPG
固相pH梯度等电聚焦原理
Separation of Proteins
一、蛋白质电泳相关基本知识 二、双向电泳
1、2-DE 常见问题及解决方法 2、对角线电泳SDS-PAGE/SDS-PAGE 3、Native-PAGE/SDS-PAGE
三、2D-LC
一、蛋白质电泳相关基本知识
1、电泳
2、聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 3、等电聚焦电泳 4、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 5、蛋白质的检测－显色剂
基于凝胶中的固相pH梯度。这些具有弱酸或弱碱性质 的丙烯酰胺衍生物共价结合到聚丙烯酰胺凝胶介质形成 pH梯度后，带电的蛋白质分子便开始向自己的等电点 位臵迁移，直到到达自己的等电点。
等电聚焦中应注意的事项
1. pH梯度的选择。先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预 试验确定。 2.IEF如在宽pH范围载体两性电解质内进行，为了克服在中性区 域形成纯水区带，可适当添加中性载体两性电解质。 3.为防止电泳过程中pH梯度的衰变，一般电流降低达最小而恒 定时尽快结束IEF。 4.pH梯度(pI)测定: ①Rotofer制备电泳可分管测定收集液的pH 值；②凝胶IEF后，可分段切割凝胶，用3—5倍体积的蒸馏水 或10mmol KCl浸泡该凝胶，从凝胶浸出液中测定pH值，或 用微电极直接测定凝胶表面pH值；③薄层等电聚焦后，可用 微电极检测凝胶表面pH值根据蛋白质分布的pH值即能确定该 蛋白质的pI。 5.IEF聚焦过程中由于蛋白质泳动到某一区段，而该区段刚好是 该蛋白质的pI，造成蛋白质的沉淀出现絮凝现象，为了解决 此问题，可在样品中添加硫脲、TritonX－100、NP—40或其 他一些非离子型表面活性剂。
固相pH梯度等电聚焦（IPG IEF）
固相pH梯度的介质 Immobilines（固相试剂）是一系列性质稳定的具有弱 酸弱碱性质的丙烯酰胺衍生物，与丙烯酰胺和甲叉双丙 烯酰胺有类似的聚合行为。每个分子都有一个单一的酸 性或碱性缓冲基团与丙烯酰胺单连。 其结构式为：
其中R代表羧基或第三氨基
固相pH梯度的建立
1.电泳
电泳：带电粒子在电场中的定向移动。
V:泳动速度cm/秒or分 d:泳动距离cm t:电泳时间 (秒/分) E:电场强度 伏特/cm
u:泳动率or泳动度(cm/伏· 秒or分) U:电压 常压(100—500v) 高压(500—10000v)仅需几分钟 l:支持场的长度 (有效长度)
电泳类型 ⑴区带电泳 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、 细丝电泳、凝胶电泳。 凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅 胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳包括：垂直板、盘状、 等电聚焦、梯度、免疫电泳 ⑵自由界面电泳 支持物为溶液，很少用。
部分而建立pH梯度（线性和非线性），分辨率比前者高 一个数量级。 在凝胶聚合时形成pH梯度
载体两性电解质合成的历史即等电聚焦技术发展的历史
1912年 两个日本科学家在一个用膜隔开的，并在阳-阴极之间按pI 值的增加排列起来的三个腔的电解槽中将蛋白水解成氨基酸。 1929年 Willians设计成多槽，减少了扩散和对流，以提高分辨率。 1948年 Svensson对此作了综述。 50 年代 Kolin提出：聚焦离子应为一个pH梯度，用蔗糖密度梯度来 稳定，并定名为“等电谱”：在一个Tiselius似的装臵中，把被分离 的物质放到酸性和碱性缓冲液中间的内界面处，通电后，利用两个 不同pH的缓冲液互相扩散平衡，在其混合区形成人工pH梯度。 1961年 Svensson提出了载体两性电解质（CA）的概念。 1964年 Vesterberg成功合成了载体两性电解质，从此开创了高分 辨率电泳技术的新阶段。
Hale Waihona Puke Problems with traditional 1st dimension IEF
Works well for native protein, not good for denaturing proteins, because:
OPERATOR DEPENDENT
1.Takes longer time to run. 2.Techniques are cumbersome. (the soft, thin, long gel rods needs excellent experiment technique) 3.Batch to batch variation of carrier ampholytes. 4.Patterns are not reproducible enough. 5.Lost of most basic proteins and some acidic protein.
1937年，瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电泳 仪，建立了移界电泳法，开创了电泳技术的新纪元。
获1948年诺 贝尔奖
70年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色
三个技术环节，不断改进，以实现下列目标：
1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。
各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。
浓缩效应--聚焦
等电聚焦的分辨率（用两个邻近带的pI差△pI来表示）
pH梯度 蛋白质迁移率的斜率
蛋白的扩散系数
场强
D和du∕d(pH)是常数，所以只有通过提高场强和使 用窄pH范围来提高分辨率。但是电压过高产生的热 会使蛋白质变性甚至烧胶，所以场强的提高受到一 定的限制。 在窄的pH范围，分辨率会明显的提高。大多数情况 下，使用载体两性电解质的等电聚焦技术可将等电 点相差0.01-0.02pH单位的蛋白质分开。使用窄的pH 范围时，甚至可达到0.0025pH和0.001pH。
等电聚焦电泳电泳时间越长，蛋白质聚焦的区带就越集中，越狭窄， 因而提高了分辨率。这是等电聚焦的一大优点，不像一般的其他电泳， 电泳时间过长则区带扩散。
载体两性电解质的缺点
（1）由于合成载体两性电解质（SCA）是通过复杂的合成过 程得到的，其重复性很难控制，由此不同批次之间会存 在很大的变化，同一点蛋白质在不同批次等电聚焦中所 出现的位臵有所偏差，这样作为双向电泳中的一向时就 限制了蛋白质分离的重复性。 （2）SCA分子量相对较小，难以在IEF胶内固定，在等电聚焦 过程中由于水合正离子引起电渗流将致使SCA分子向负 极迁移（负极漂移），结果使pH值的不稳定性增加。 （3）负极漂移作用对碱性区蛋白质的影响尤其重要，结果常 导致碱性区蛋白质难以成功聚焦甚至导致碱性区蛋白质 的丢失。 （4）每一次灌制SCA凝胶的重复性难以控制，而且这种凝胶 的机械稳定性差，易拉伸变形或断裂，同样导致重复性 的降低。
蛋白质的等电点（pI）：当某蛋白质在一定的pH的溶 液中，所带的正负电荷相等，它在电场中既不向阳极 也不向阴极移动，此时溶液的pH值叫做该蛋白质的等 电点。 取决于其氨基酸的组成，是一个物理化学常数。 蛋白质的带电性质与溶液的pH有关 不同Pr其aa的数量、种类及占比例不同，pI不同
基本原理：利用蛋白质分子或其他两性分子等电 点的不同，在一个稳定的、连续的、线性的（或 非线性）pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。
这些科学家的努力为等电聚焦技术奠定了理论的和实践的基础。
载体两性电解质pH梯度等电聚焦：在支持介质中放入载体两 性电解质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有 两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴 定的目的。
载体两性电解质（CA）应具备的条件
(1)在等电点处必需有足够的缓冲能力，以便能控制pH梯度,而 不致被样品蛋白质或其他两性物质的缓冲能力而改变pH梯度 的进程。 (2)在等电点必需有足够高的电导，以便使一定的电流通过，而 且要求具备不同pH值的载体有相同的电导系数，使整个体系 中的电导均匀；如果有局部电导过小，就会产生极大的电位 降，从而其他部分电压就会太小，以致不能保持梯度，也不 能使应聚焦的成分进行电迁移，达到聚焦。 (3)分子量要小，便于与被分离的高分子物质用透析或凝胶过滤 法分开。 (4)化学组成应不同于被分离物质，不干扰测定。 (5)应不与分离物质反应或使之变性。 常用的载体两性电解质为多氨基多羧酸的脂肪族化合物， 分子量为300-1000，是由多乙烯多胺和丙烯酸加合而成。
载体两性电解质在电场中形成pH梯度的模式图
载体两性电解质分离原理
在支持介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性 电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的线性的pH梯度（预电 泳）。当蛋白质放进此体系时，靠近阳极侧的蛋白质处于酸性环 境中，带正电荷向负极移动；靠近阴极的蛋白质处于碱性环境中， 带负电荷向正极移动，最终都聚焦于与其等电点相当的pH位臵上， 形成不同的蛋白质区带。IEF样品可臵于任何位臵。
三种物理效应
⑴样品浓缩效应:由凝胶系统的不连续性产生 ⑵分子筛效应 ⑶电荷效应
电泳仪器
⑴垂直板电泳仪
⑵圆盘电泳仪
夹心垂直板电泳槽示意图
3.等电聚焦电泳 (Isoelectro focusing IEF or EF)
1966年瑞典科学家Rible和Vesterberg建立 分辨pI只差0.001pH单位的生物分子
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳 (polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)
单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺 (N,N-methylene-bisacylamide,简称Bis) 加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED) 催化剂过硫酸铵(简称AP) 核黄素(ribofavin即vita min B2,C17H2O6N4)
载体两性电解质pH梯度的形成
CA是两性分子,在凝胶聚合时形成两性分子在电场中,CA迁 移到自己的pI而形成pH梯度. 产生pH梯度的方法有两种： ①用两种不同pH的缓冲液互相扩散，在混合区形成pH梯度。 人工pH梯度，不稳定，且重复性差，现已不使用。 ②利用CA在电场作用下自然形成pH梯度，即天然pH梯度。 常用。
根据一定的计算后，把两种不同pK值的Immobilines 贮液按重力梯度混合，分别为相对酸性和碱性的丙烯酰胺 衍生物缓冲液的混合物，两种溶液中不同缓冲液的浓度决 定了所形成的pH梯度的范围和形状。两种溶液都含有丙烯 酰胺单体和催化剂，在聚合过程中，缓冲液中的丙烯酰胺 单体和甲叉双丙烯酰胺单体聚合，形成聚丙烯酰胺凝胶， 缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中，形成 pH梯度。
4.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（1967年 Shapiro）
原理 蛋白质样品在100℃用SDS和还原剂处理解聚成亚基 各种SDS-Pr均带相同密度的负电荷，其荷电超过了原Pr， 消除了不同Pr荷电差异。 加入SDS，改变了Pr的构象，SDS-Pr为长椭圆棒，各种短 轴约为1.8nm。
5.蛋白质的检测－显色剂
理想显色剂的7S 安全（safety） 灵敏（sensitivity） 简单（simplicity） 特异性（specificity） 快速（speed） 稳定（stability） 兼容性（synergy）
有机染料和银染
考染灵敏度为30－100ng，线性范围是20倍；银染的线 性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。 胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的无背景染色， 其极限灵敏度为8－10ng，但这种染液会对蛋白质进行 修饰而影响质谱分析的结果。 胺基黑常用于转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）和/或硝酸 纤维素膜上的蛋白质的染色。 银染的缺点是：对某些种类的蛋白质染色效果差，对其 后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。 这两种染色技术都可减少胶内蛋白质产量。
pH梯度建立
等电聚焦技术的关键
载体两性电解质pH梯度(Carrier ampholytes pH gradients，
CA):在电场中通过两性缓冲离子建立的pH梯度(线性)(共
电泳)。
固相pH梯度(1975年)（immobilized pH gradients，
IPG） 将缓冲基团共价键合在介质上成为凝胶介质的一
固定干胶条（immobiline pH gradients, IPG）的概 念：胶条由基质和聚丙稀酰胺形成一个整体，pH梯度的 产生是由酸性和碱性基团与聚丙稀酰胺以梯度式共价键 连接而形成。即使在电场中，它也是“固相”的。
Schematic drawing of a IPG
固相pH梯度等电聚焦原理