疾病相关基因的发现及功能研究@

☻金标准：差异基因最终确认用Northern杂交
其它方法
☻ 基因表达系列分析(serial analysis of gene expression，SAGE) ☻ DNA芯片(DNA Chips) ☻ 几种方法的综合运用
翻译水平差异表达研究策略
蛋白质水平分析
☻蛋白质组学：一个蛋白质组是由一个 基因组或任何细胞／组织表达的所有 种类蛋白质
脑缺血/缺氧相关基因的克隆
研究背景、目的
☻脑缺血（缺血性中风）特点：常见病、多发病、高致 残率、高死亡率，年新发病例超过150万 ☻脑缺血致脑损伤机理: 自由基、能量消耗、兴奋性氨 基酸毒性、钙超载、细胞凋亡学说 ☻目前存在的问题：脑缺血发病机理复杂、涉及的许多 环节尚未完全阐明、作用靶点缺乏特异性，临床疗效 不佳。 ☻目标：寻找新的靶点 体内存在脑缺血保护性因素，我们的研究目的就是 揭示和阐明这些内在保护性机制，寻找新的预防和治 疗脑缺血的靶点
缺
点
同其他方法相比较 ☻一是假阳性多(约50 %～70 %) ☻二是得到的有差异cDNA片段短 (约为 110～500 bp)
假阳性的原因
☻ 提取总RNA时, 有染色体DNA污染,此DNA 作为模板在PCR过程中被扩增 ☻ 从聚丙烯酰胺胶上挑选有差异条带时,实验 组与对照组间信号对比不够显著 ☻ 在克隆阶段挑选阳性菌落时,未能排除基因 克隆中的假阳性 ☻ 研究中多次使用PCR技术,很难避免实验室 环境中的交叉污染
Control Experiment
Up regulated gene Down regulated gene
Differential Display gene
T-clone
Sequence
Informatics analysis
Verify
Northern blot RT-PCR Tral time RT-PCR
缺血与非缺血组织RNA的提取
☻ 提取RNA的纯度和完整 性 纯度检验： A260/A280＝1.96 完整性检验： 电泳结果见图2
Fig 2 The electrophoresis of RNA of cerebral ischemia and nonischemia
差异显示PCR结果(图谱)
部分差异片段测序结果
表 1 FDD RT-PCR差异显示EST序列同源性分析结果 (2001年分析结果).
解决方法
☻提取RNA操作严格,得到的RNA 必须经过脱氧核糖 核酸酶I(DNaseI)充分消化, 去除染色体DNA污染 ☻切取有差异条带时,首选实验与对照间信号差异显 者,最好是互为有或无的关系; 仅仅是强与弱的关系, 放在次选位置上 ☻即使是差异显著地显现为一条带,也不能肯定是由 某一cDNA的均一分子泳动而成, 有可能是结构不 同而分子量相同的cDNA共泳动的结果 ☻交叉污染问题的克服应服从分子生物学一般原则
基因的表达调控
基因的表达主要是通过： ☻控制转录 转录的启动 转录的速度 转录后的修饰 ☻控制翻译实现 翻译的启动 翻译后的修饰
基因差异性表达的研究策略
☻ 转录水平：差异性表达mRNA 水平分析 a. DD RT-PCR技术 b. 差减杂交 c. 抑制差减杂交 d. 基因表达系列分析(SAGE)
脑缺血模型的制作
• 动物：250-280 g SD雄性大鼠。
• 采用MCAO(Middle Cerebral Artery
动脉栓塞模型：TTC染色结合动物行为学改变确 Occlusion)大脑中
认模型成功
取大鼠脑缺血2小时
R
L
缺血侧组织
非缺血侧组织 进行研究
R: ischemia; L: non-ischemia Stain with TTC
巢式(Nest) PCR
☻ 两次杂交后，填平粘性末端，利用巢式 PCR(nested PCR)原理进行扩增 ☻ e型分子两端都能和引物配对，扩增效率高 ☻ c型的双链分子只在一端有一个引物配对， 扩增效率比e型分子低得多 ☻ b型分子由于两端有长序列的反向重复，可 互补形成牢固的“锅一柄”二级结构，无 法进行有效扩增 ☻ e就是差异表达的基因
☻ 原理：以抑制PCR为基础的cDNA消减杂交 方法：利用非目标序列片段两端的长反向 重复序列在退火时产生“锅一柄”结构，
无法与引物配对，从而选择性地抑制非目
标序列的扩增
Test
Control
mRNA RT→cDNA
RsaI/ HaeIII酶切
Test cDNA分成两部分
连上接头
连上接头
加入过量的control cDNA
☻ 翻译水平: protein electrophoresis
转录水平
方法基本要求
寻找mRNA 表达的差异, 至少要满足下列要求 ☻ 在一定时、空里,约有15 000 种mRNA表达 /cell, 除少数属高丰度、大量的属于低丰度表 达, 使用的方法足以显示低丰度mRNA ☻ 重复性要好 ☻ 实验过程中能够步步验证比较 ☻ 得到的产物能代表相应的mRNAs或cDNAs , 并能由此找到相应的cDNA序列 ☻ 省时,简便易行
疾病相关基因的筛选
及其功能研究
生物体基因表达
☻多细胞生物的正常生长、发育、衰老 以及病理状态下组织细胞的结构与功 能的变化，归根结底为基因
☻在一定时间上
☻在一定空间上
的选择性表达，即基因的差异性表达
人类基因组及表达概况
☻ 人类单倍体基因组由3.2xl06bp DNA组成，含 有2～3万个基因 ☻ 在一般情况下任何类型的细胞大约只表达一 部分基因，约产生5 000-15 000种蛋白质 ☻ 每一特定发育时期或每种组织特异表达其基 本与独特的蛋白质 ☻ 正常成人体内约含有250种以上不同类型细胞
☻同一种mRNA可因不同的剪接或翻译 后加工产生多种蛋白质，故一个蛋白 质组的蛋白质数量可超过相应基因组 的基因数目
蛋白质组学研究常用技术
☻二维凝胶作图(2D—gel mapping) ：二维 凝胶作图是在同一块凝胶上，一个面上依据 蛋白质的等电点(pI)，另一面上依据蛋白质 的分子量进行电泳，将各种不同蛋白质分开， 这种方法可同时分析数千种蛋白质
C、限制型差异显示PCR
☻ mRNA反转录成双链cDNA
☻ 再用同一限制酶(首先识别4bp的酶)消化 cDNA ☻ 并把酶切片段分别加上接头后进行特异 PCR扩增 ☻ 获得差异表达片段
优
点
☻通过使用限制酶将cDNA杂交度降低
☻降低了杂交后无关重复序列对富集的 靶序列的污染 ☻假阳性率相对低得多
缺 点
凝胶的高分辨率和高度重复是运用二维凝胶 电泳分离许多种复杂蛋白质混合物的前提
二维凝胶作图方法
2种方法：
☻垂直平板凝胶(vertical slab gels)
☻超薄水平凝胶(ultra-thinhorizontalgels)
☻均采用梯度凝胶(9-16％聚丙烯酰胺)， 可分离5--200kD蛋白
检 测
变性后杂交
第一次杂交
第一次杂交后有4种产物： ☻ a是单链test cDNA ☻ b是自身退火的test cDNA双链 ☻ C是test和control的异源双链 ☻ d是单链control cDNA 目的 第一次杂交是使test单链cDNA均等化， 使原来有丰度差别的单链cDNA的相对含 量达到基本一致
Three techniques
☻ RT: Reverse-Transcription:
☻ PCR: Polymerase Chain Reaction ☻ PAGE Sequence gel electrophoresis
Control
Experiment
mRNA
RT
PCR
PAGE electrophoresis
☻根据实验目标和所需灵敏度采用银染、 考马氏亮蓝或放射自显影检测
☻采用激光密度扫描(laser densitometer)、 磷显影仪(phosphor-imager)等扫描装置
结果分析
二维凝胶参照图谱(2D-gel referenced maps)
☻ 利用电子计算机分析构建二维凝胶参照图 谱 ☻ 最后通过微测序、肽图(peptidmapping)、 免疫和cDNA短暂超表达等研究 ☻ 最后确立蛋白质结构，并与蛋白数据库及 DNA数据库的信息进行比对、分析 ☻ 得出结论
原
理
☻ 丰度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交 的速度要快于丰度低的单链cDNA.
目
的Biblioteka Baidu
☻ 由于test cDNA中和control cDNA序列相似 的片段大都和control形成异源双链分子C， 使test cDNA中的差异表达基因的cDNA得 到大量富集
第二次杂交
☻ 合并两份杂交产物，另加上新的变性 control单链，再次杂交退火 ☻ 只有第一次杂交后剩余的经均等化和消减 的单链test cDNA能与control cDNA一起 形成各种双链分子 ☻ 这次杂交进一步富集了差异表达基因的 cDNA,并产生了一种新的双链分子e，这种 分子的两个5'端有两个不同的接头，正是由 于这两个不同的接头，使其能在以后的 PCR中被有效地扩增。
☻ 每种细胞大约表达300—400种不同于其他细 胞的特异性蛋白质 ☻ 脊椎动物细胞总蛋白的35％---80％在各种组 织之间互不相同而构成所谓标志蛋白，也称 看家基因 ☻ 如糖代谢、DNA修饰和蛋白合成等有关酶的 选择性表达基因多为低丰度的基因 ☻ 我们对其中绝大部分基因及表达产物功能尚 不了解，在疾病中的意义不明
抑制消减杂交法的优点
☻ 降低假阳性率
☻ 两步杂交和两步PCR，保证了该方法具有 较高的特异性 ☻ 具有高度敏感性：它的均等化和对目标片 段的富集，保证了低丰度mRNA也有被检 测的可能
抑制消减杂交法的缺点
☻ 该方法若是mRNA量不够，那么低丰度的 差异表达基因的cDNA很可能会检测不到
☻ 其次，消减库中的cDNA因为已被限制酶 消化，不再是全长cDNA ☻ 步骤繁琐，工作量大
A、差减杂交(subtractive hybridization)
☻差减杂交是利用目的基因在两种组织 或细胞中表达的差异，通过其mRNA 或单链cDNA进行液相杂交，除去两者 之间相同的基因成分取得。
Control
Experiment
mRNA RT→cDNA
标记生物素
不标记生物素
Hybridization
Conclusion
Gene function analysis
In vitro analysis
In vivo analysis
Tissue distribution Sub-cell location Over expression RNAi Knock out Transgene
Immunohistology Confocal & Microscopy
☻ 但RDA无法检测缺乏合适内切酶位点的表 达序列
☻ 类似抑制差异杂交技术，它只能获得较短 的靶基因探针，用几个甚至几十个探针分 别去筛选全长cDNA绝不是一件容易的事情 ☻ 另一方面cDNA RDA降低复杂性也可能造 成一些信息的丢失
D、mRNA DD RT-PCR
☻ mRNA differential display RT-PCR
生物素亲和层析柱 未结合的洗脱下来
克隆、测序
得到差异表达基因
优 点
☻利用降低了复杂度的差减文库进一步 作差异杂交，能够显著提高差异杂交 的效率
缺 点
☻目的基因片段的富集程度有限 ☻假阳性比例较高 ☻需大量的mRNA(>20mg)
B、抑制差减杂交(supression subtractive hybridization ,SSH)
优
点
同其他方法相比较 ☻ 微量样品：仅需0.2μg总RNA作为起始材料 ☻ 高通量：可同时分析多组样品 ☻ 敏感性：高, 可检出低丰度mRNA ☻ 实验周期： 短, 约8天即可完成, 便于重复 ☻ 脚踏实地：步步验证比较 可简单地将DD的特点概括为“3SRV”,即 “Simplicity, Sensitivity, Speed, Reproducibility, Versatility”
研究技术路线
制作MCAO大鼠脑缺血模型 ↓ 荧光差异显示PCR ↓ 脑缺血相关差异显示EST片段的获得 ↓ 差异显示EST片段的筛选确认 ↓ 获取目标基因全长 ↓ 生物信息学分析研究 ↓ ↓ 制备抗体 基因表达的功能研究 ↓ 过表达 RNAi 转基因动物 ↓ ↓ ↓ ↓ 组织表达谱分析 体内外 体内外 子代性状研究