链霉菌基因实验操作
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LA
LB中加入终浓度为1.5-2%的琼脂粉(不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需1.5%，而华美的需要2%)。
＊做蓝白斑筛选时不加葡萄糖
基本培养基（MM）
溶液：L-天冬酰胺0.5g，
K2HPO4 0.5g,
MgSO4·7H2O 0.2g,
FeSO4·7H2O 0.01g,
蒸馏水至1000ml
将每250ml溶液分装到装有2.5g琼脂的500ml三角瓶中，灭菌，使用时每瓶加入50％葡萄糖（8磅灭菌）5ml，调pH7.0。
配置MM的琼脂有lab agar、Ice agar(IA)
R5（1L）链霉菌原生质体转化时用
蔗糖103g
K2SO4 0.25g
MgCl2·6H2O 10.12g
葡萄糖10g
Difco酪蛋白氨基酸0.1g
微量元素溶液2ml
Oxoid酵母提取物5g
TES 5.73g
加蒸馏水至1000ml
称取5.5g Difco琼脂放入500ml三角瓶中，倒入250ml上述溶液，然后塞上塞子后8磅灭菌（114度15分种）。使用时，将培养基融化，每瓶中加入：
KH2PO4(0.5%) 2.5ml
CaCl2·2H2O(5M) 1ml
L-脯氨酸(20%) 3.75ml
NaOH(1M)调pH至7.3
对营养缺陷型菌株加入适当的营养因子（请参考《手册》）
YEME(酵母膏-麦芽膏培养基) 1L（液体培养链霉菌）
Oxoid酵母提取物3g
Oxoid蛋白胨Tryptone 5g
麦芽提取物（BD公司原Difco公司218630）3g
葡萄糖10g
蔗糖＊340g
蒸馏水至1000ml
高压灭菌后加入：（8磅灭菌，113－114゜C，15min，自动灭菌锅一次不能灭过多东西，否则会灭不彻底。）
MgCl2·6H2O(2.5M) 2ml/L
制备原生质体时，还要加入：
甘氨酸（20%）＊25ml/L
＊蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。
＊甘氨酸被认为能干扰链霉菌细胞壁的形成，使菌丝体片段更短，利于溶菌，有利于外源DNA的导入。
TSBY（1L）（液体培养链霉菌）
Oxoid胰胨豆汤粉（TSB）30g
蔗糖＊340g
Oxoid酵母抽提物5g
蒸馏水至1000ml
*不同菌株培养需要不同浓度的蔗糖，蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。
MS培养基
将黄豆饼粉加蒸馏水煮2到3小时，用纱布过滤得到滤液，将每250ml滤液分装到装有5g琼脂，5g 甘露醇的500ml三角瓶中，10磅灭菌，使用时调pH7.2-7.3。
2CMY培养基（用于井岗的接合转移）
可溶性淀粉10g
胰蛋白胨2g
NaCl 1g
(NH4 )2SO4 2g
K2 HPO4 1g
CaCO3 2g
无机盐溶液* 1 ml
琼脂20g
蒸镏水1000 ml
PH7.2
无机盐溶液(每升)
FeSO4 .7H2 O 1g
MgCl.6 H2 O 1g
大肠杆菌质粒的抽提
苯酚/氯仿溶液抽提法
1. 接种5ml LB，37℃摇床过夜培养（12小时）
2. 离心，3000rpm，5min去上清
3. 振荡混匀沉淀，分装在2个离心管中，spin一下，吸去上清，加入150μl的溶液I （50mmol/L葡萄糖, 25mmol/L Tris·Cl(PH8.0), 10mmol/L EDTA(PH8.0) 在10lbf/in2
（6.895×104Pa）高压蒸气下灭菌15min（8磅），贮存于4℃），剧烈振荡5分钟打散菌体（菌体不打散容易在产物中出现较多蛋白）。
4. 加入300μl溶液II（0.2mol/LnaOH, 1%SDS, 用2倍的溶液现配现用）后立即振荡混
合均匀，处理2分钟后加入225μl溶液III（5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml）混合均匀，12000rpm离心5min，取上清液中于新的离心管。
5. 加120μl酸性苯酚/氯仿溶液，振荡混匀，12000rpm离心5min，再取上清液中于新的离心管中。
6. 用120ul氯仿重复操作5。
7. 加等体积的异丙醇或2倍体积的乙醇，混匀，12000rpm离心7min。
8. 沉淀用70%乙醇洗涤两次,每次10min。50℃烘干后加适量无菌去离子水（ddH2O）
溶解，-20℃保存。
氯化锂抽提法
1. 前四部同苯酚/氯仿溶液抽提法（用Solution I II III处理）
2. 加等体积的异丙醇，混匀，沉淀DNA，12000rpm离心7min。去上清，尽量去干净。
3. 用少量70％乙醇洗一下（洗去异丙醇），离心去尽酒精，50℃烘干沉淀，用适量ddH2O （100ul）充分溶解（可在50度水浴中助溶）后加入4/5体积的氯化锂溶液（浓度约10mol/L）处理1min沉淀RNA和蛋白。
4. 12000rpm离心5min，取上清液于新的离心管中，用等体积的异丙醇混匀，12000rpm 离心8min，去上清。
5. 将沉淀用70%乙醇洗涤两次,每次10min。50℃烘干后加一定量的无菌去离子水（ddH2O）溶解，-20℃保存。
酶连反应
一般采用10μl反应体系：
T4连接酶1μl，连接酶缓冲液1μl，外源片段与载体按DNA 摩尔含量3:1加入即可。
如果是粘端连接，则需把外源片段和载体的混合物在50度处理10分钟使粘端变性，然后立即放入冰中5分钟。
平端连接采用14度，粘端连接采用16度，连接4小时以上（一般可过夜）。
＊外源片段与载体按DNA 摩尔含量为3:1或外源更多。
DNA片段凝胶回收
1试剂盒回收(离心法)（详见说明书）
(1) 在长波紫外灯下切下含有目标DNA的琼脂糖凝胶,用纸巾吸干凝胶表面的液体并切小.计算凝胶的重量,该重量作为一个凝胶体积(如1oomg=1ooul)