链霉菌基因实验操作

LA
LB中加入终浓度为1.5-2%的琼脂粉(不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需1.5%，而华美的需要2%)。

＊做蓝白斑筛选时不加葡萄糖
基本培养基（MM）
溶液：L-天冬酰胺0.5g，
K2HPO4 0.5g,
MgSO4·7H2O 0.2g,
FeSO4·7H2O 0.01g,
蒸馏水至1000ml
将每250ml溶液分装到装有2.5g琼脂的500ml三角瓶中，灭菌，使用时每瓶加入50％葡萄糖（8磅灭菌）5ml，调pH7.0。

配置MM的琼脂有lab agar、Ice agar(IA)
R5（1L）链霉菌原生质体转化时用
蔗糖103g
K2SO4 0.25g
MgCl2·6H2O 10.12g
葡萄糖10g
Difco酪蛋白氨基酸0.1g
微量元素溶液2ml
Oxoid酵母提取物5g
TES 5.73g
加蒸馏水至1000ml
称取5.5g Difco琼脂放入500ml三角瓶中，倒入250ml上述溶液，然后塞上塞子后8磅灭菌（114度15分种）。

使用时，将培养基融化，每瓶中加入：
KH2PO4(0.5%) 2.5ml
CaCl2·2H2O(5M) 1ml
L-脯氨酸(20%) 3.75ml
NaOH(1M)调pH至7.3
对营养缺陷型菌株加入适当的营养因子（请参考《手册》）
YEME(酵母膏-麦芽膏培养基) 1L（液体培养链霉菌）
Oxoid酵母提取物3g
Oxoid蛋白胨Tryptone 5g
麦芽提取物（BD公司原Difco公司218630）3g
葡萄糖10g
蔗糖＊340g
蒸馏水至1000ml
高压灭菌后加入：（8磅灭菌，113－114゜C，15min，自动灭菌锅一次不能灭过多东西，否则会灭不彻底。

）
MgCl2·6H2O(2.5M) 2ml/L
制备原生质体时，还要加入：
甘氨酸（20%）＊25ml/L
＊蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。

＊甘氨酸被认为能干扰链霉菌细胞壁的形成，使菌丝体片段更短，利于溶菌，有利于外源DNA的导入。

TSBY（1L）（液体培养链霉菌）
Oxoid胰胨豆汤粉（TSB）30g
蔗糖＊340g
Oxoid酵母抽提物5g
蒸馏水至1000ml
*不同菌株培养需要不同浓度的蔗糖，蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。

MS培养基
将黄豆饼粉加蒸馏水煮2到3小时，用纱布过滤得到滤液，将每250ml滤液分装到装有5g琼脂，5g 甘露醇的500ml三角瓶中，10磅灭菌，使用时调pH7.2-7.3。

2CMY培养基（用于井岗的接合转移）
可溶性淀粉10g
胰蛋白胨2g
NaCl 1g
(NH4 )2SO4 2g
K2 HPO4 1g
CaCO3 2g
无机盐溶液* 1 ml
琼脂20g
蒸镏水1000 ml
PH7.2
无机盐溶液(每升)
FeSO4 .7H2 O 1g
MgCl.6 H2 O 1g
大肠杆菌质粒的抽提
苯酚/氯仿溶液抽提法
1. 接种5ml LB，37℃摇床过夜培养（12小时）
2. 离心，3000rpm，5min去上清
3. 振荡混匀沉淀，分装在2个离心管中，spin一下，吸去上清，加入150μl的溶液I （50mmol/L葡萄糖, 25mmol/L Tris·Cl(PH8.0), 10mmol/L EDTA(PH8.0) 在10lbf/in2
（6.895×104Pa）高压蒸气下灭菌15min（8磅），贮存于4℃），剧烈振荡5分钟打散菌体（菌体不打散容易在产物中出现较多蛋白）。

4. 加入300μl溶液II（0.2mol/LnaOH, 1%SDS, 用2倍的溶液现配现用）后立即振荡混
合均匀，处理2分钟后加入225μl溶液III（5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml）混合均匀，12000rpm离心5min，取上清液中于新的离心管。

5. 加120μl酸性苯酚/氯仿溶液，振荡混匀，12000rpm离心5min，再取上清液中于新的离心管中。

6. 用120ul氯仿重复操作5。

7. 加等体积的异丙醇或2倍体积的乙醇，混匀，12000rpm离心7min。

8. 沉淀用70%乙醇洗涤两次,每次10min。

50℃烘干后加适量无菌去离子水（ddH2O）
溶解，-20℃保存。

氯化锂抽提法
1. 前四部同苯酚/氯仿溶液抽提法（用Solution I II III处理）
2. 加等体积的异丙醇，混匀，沉淀DNA，12000rpm离心7min。

去上清，尽量去干净。

3. 用少量70％乙醇洗一下（洗去异丙醇），离心去尽酒精，50℃烘干沉淀，用适量ddH2O （100ul）充分溶解（可在50度水浴中助溶）后加入4/5体积的氯化锂溶液（浓度约10mol/L）处理1min沉淀RNA和蛋白。

4. 12000rpm离心5min，取上清液于新的离心管中，用等体积的异丙醇混匀，12000rpm 离心8min，去上清。

5. 将沉淀用70%乙醇洗涤两次,每次10min。

50℃烘干后加一定量的无菌去离子水（ddH2O）溶解，-20℃保存。

酶连反应
一般采用10μl反应体系：
T4连接酶1μl，连接酶缓冲液1μl，外源片段与载体按DNA 摩尔含量3:1加入即可。

如果是粘端连接，则需把外源片段和载体的混合物在50度处理10分钟使粘端变性，然后立即放入冰中5分钟。

平端连接采用14度，粘端连接采用16度，连接4小时以上（一般可过夜）。

＊外源片段与载体按DNA 摩尔含量为3:1或外源更多。

DNA片段凝胶回收
1试剂盒回收(离心法)（详见说明书）
(1) 在长波紫外灯下切下含有目标DNA的琼脂糖凝胶,用纸巾吸干凝胶表面的液体并切小.计算凝胶的重量,该重量作为一个凝胶体积(如1oomg=1ooul)
(2) 根据凝胶的浓度,加DE-A 液
凝胶浓度DE-A溶液体积
≤1.0%3个凝胶体积
≤1.5% 4 个凝胶体积
≤2.0% 5 个凝胶体积
混匀后于75o C加热,(低熔点琼脂糖凝胶于45o C加热),间断混合,直到凝胶熔化(6-8分钟). (3) 加0.5个DE-A体积的DE-B溶液,混匀(是否需调整PH值,见注意事项1);当分离的DNA 片段小与400bp 时,加入异丙醇至终浓度为20%;
(4) 吸3中的混合液,转移到DNA制备管,3600rpm离心1分钟.如制备管中有残留,适当提高速度,再离心1分钟,去滤液;
(5) 将制备管置回离心管,加0.5ml W1溶液,3600rpm离心30,弃滤液;
(6) 将制备管置回离心管,加0.7ml W2溶液,3600rpm离心30,弃滤液,重复一次; （W2中含有酒精，应保证瓶子密封。

）
(7) 将制备管置回离心管,最高速度离心1分钟;
(8) 将制备管置洁净的1.5 ml 离心管中,在DNA制备膜正中央加25ul水或洗脱液,室温静置1分钟.最高速度离心1分钟洗脱DNA.
注意事项;
1. 此法适合从TAE或TBE琼脂糖凝胶中回收DNA,用其他缓冲液时,加DE-B溶液后,溶液的PH要调整到6.5以下.
2. 勿将DNA长时间暴露在高温下,线型DNA于高温条件下易水解.勿将凝胶长时间暴露在紫外灯,减少紫外灯对DNA的损伤.
3. 2步骤中的凝胶必须完全熔化,否则将严重影响DNA的回收效率.
4. 步骤4中吸回滤液到DNA制备管中再吸附一次,可提高回收效率.将洗脱液或水加热到60゜C,可提高回收效率。

（重要）
5. DNA分子呈酸性,建议在洗脱液中保存。

（试剂盒中提供的洗脱液好像对PCR有某种抑制作用。

）
2 silica回收
1 在长波紫外灯下切下含有目标DNA的琼脂糖凝胶, 用纸巾吸干凝胶表面的液体并切小.计算凝胶的重量;
2. 加入2-3倍体积的6M KI或NaI（避光4度保存）;
1. 65 o C温浴, 间断混合,直到凝胶熔化;
2. 加适量的振匀的silica悬液（10ul）充分混匀, 冰上放置15分钟（或更长）,间断混合;
3. 5000rpm离心3分钟, 弃上清;
4. 加1ml预冷的NEW buffer（先用100ul打散沉淀，再用900ul混匀），冰上洗盐2
分钟，间断混合;
5. 12000 rpm离心10s, 弃上清;
6. 重复6,7步骤1次;
7. 于50 o C烘箱烘干;
8. 加10ul的去离子水用枪头打匀,65 o C水浴15分钟,间断混匀;
9. 12000 rpm离心10 s，把上清转移到另外洁净的离心管中;
10. 跑胶检测回收效率.
注意事项
＊4----8步均在冰上操作，防止解吸附，silica只在低温下对DNA有吸附作用。

＊NEW Buffer：（100ml）
1ml 5M Nacl, 1ml 1M pH7.5 This-HCl, 0.5ml 0.5M EDTA, 50ml 100% ETOH, 去离子水加至100ml。

（-20度保存）
＊Silica配法见：TIG January 1995 Vol.11 No. 1. An inexpensive alternative to glassmilk for DNA purifyication.
DNA纯化
用苯酚:氯仿抽提
1. 把样品至置于离心管中,加入等体积的苯酚:氯仿,
2. 混匀,使之成为乳浊状;
3. 12000rpm离心, 5 分钟:
4. 用枪头把水相移到另一离心管中.
5. 加入等体积氯仿并重复2—4
6. 用2/3体积的异丙醇（或2倍无水乙醇）,1/10体积的3M醋酸钠,沉淀10分钟（-20度长时间沉淀可提高产量）
7. 12000rpm离心5分钟,弃液体
8. 70%的乙醇洗盐10分钟，去上清，
9. 重复8一次，再12000rpm离心弃液体.
10. 50度烘干.
11. 去离子水溶解。

LiCl抽提
1把样品至置于离心管中,加4/5体积10M LiCl
2 室温下静置1分钟
3 12000rpm离心5分钟
4把液体转移到另一离心管中
5.加2/3体积的异丙醇沉淀10分钟
往下的步骤同于上面的8-12
E.coil总DNA的提取
1 将过夜培养的大肠杆菌离心去上清。

2 加500μl水重悬浮，加入500μl 2% SDS, 混合振荡约1min，55℃温育15min，直到溶液的粘度显著下降。

3 加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠（自然pH）。

4 加入150μl中性苯酚，混合振荡均匀后，12000rpm离心5min，移取上清液，弃去白色中间层。

5 用中性苯酚/氯仿重复抽提直至看不见（或非常少）中间层为止，
6 加入1倍体积的异丙醇（或2倍体积的无水乙醇），上下颠倒混合直至出现白色絮状DNA 沉淀团，用吸头挑出DNA沉淀团。

7 用70%乙醇洗涤DNA沉淀团两次。

8 烘干，溶解DNA沉淀。

链霉菌质粒DNA的小量提取（还需改进）
1 将适量的菌体悬浮于500μl溶菌酶溶液（2％）中，37℃温育1hr 左右至完全溶菌，
2 加入500μl碱性SDS溶液（0.3mol/L NaOH, 2%SDS），立即振荡混合完全，
3 打开管盖，在70℃放置15min（对大于20kb的质粒则最好放在55℃, 30min），然后于水浴中冷却至室温，
4 加入100μl酸性苯酚/氯仿溶液，用混合器振荡至液体彻底混合均匀，12000rpm离心
5min，移取上清液，弃去白色中间层。

5 用中性苯酚/氯仿重复抽提直至看不见（或非常少）中间层为止。

6 在上清液中加入1/10体积的3M NaAc溶液和1倍体积的异丙醇沉淀5分钟（或2.2倍体积的无水乙醇沉淀1h），12000rpm离心8min，
7用70%乙醇洗涤沉淀两次,
8干燥后加一定量的TE（d2H2O）缓冲液溶解。

另：可使用抽提总DNA的试剂盒，将总DNA与质粒DNA一起抽提。

去磷酸化处理（详见分子克隆实验指南以及Takara的CIAP使用说明）
注：CIAP一般为原酶，酶量过大会失去粘性末端，因此应适当减小酶的用量，一般0.5 ul即可。

也可减少温浴时间，如37℃,10~20min即可。

AT克隆（详见说明书）
所用的载体:pGEM-T , pGEM-T Easy Vetor System
1. 酶连
(1) 体系10ul
standard Reation Positive control Background control
2X Rapid Ligation Buffer, T4 DNA Ligation 5ul 5ul
5ul
pGEM-T , pGEM-T Easy Vetor(50ng) 1ul 1ul
1ul
PCR product Xul ---
---
Control insert DNA --- 2ul
---
T4 DNA Ligase(3 weiss untis/ul) 1ul
Deionized water to a final volume of 10ul 10ul
10ul
(2).反应4o C过夜
注:PCR产物和载体的摩尔比为:
(ng of vector x kb size of insert)/(kb size of vector)*(insert: vector ration)=ng of insert
一般外源和载体的摩尔比例为3:1
T载体大小为3bkb 50ng
2. 转化
(1) 取大肠杆菌感受态细胞100ul, 连接产物2-5 ul 加入1.5ml的离心管中,混匀.冰上放置20分钟.
(2) 42o C热激90秒.(不要摇动)
(3) 立即置冰上3-5分钟.
(4) 加1ml SOC培养基(室温)
(5) 37o C培养1.5小时(约150rpm摇动).
(6) 离心,去上清,余下的混匀涂皿(LB/抗生素/IPTG/X-Gal).
(7) 37o C培养16—24小时,挑白斑.
＊所用的培养基:
SOC培养基
胰蛋白胨2g
酵母抽提物0.5g
1M NaCl 1ml
1M KCl 0.25ml
2M Mg2+储液1ml
2M 葡萄糖1ml
* Mg2+储液
MgCl.6H2 O 20.33 g
MgSO4.7 H2 O 24.65g
加双蒸水到100ml,过滤灭菌
* 葡萄糖过滤灭菌
Southern Blot
转膜
1. DNA经酶切后，用Agarose凝胶电泳分离，切去多余的胶块并在右下角切去一角以便于识别方向，接着EB染色并拍照。

（注意：TAE需新配，凝胶浓度视片段大小而定，一般为0.8%~1.0%，电压1~50v/cm）
2. 拍照后的凝胶先用无菌的去离子水轻轻摇晃，洗2次，5min/次。

3. 去嘌呤：在室温下，把凝胶置于盛有0.25M HCl的大平皿中轻轻摇动，直到溴酚蓝由蓝变黄（如果杂交的目标片段小于5kb，此步可省略），再用无菌水摇动洗5min 。

4. DNA变性：把凝胶放入盛有变性液的平皿中，轻轻摇动，洗2次，15min/次，再用无菌水洗5min。

5. 中和：把凝胶放入盛有中和缓冲液的平皿中，轻轻摇动，洗2次，15min/次。

6. 把凝胶放入盛有20x SSC的平皿中，平衡10min。

7. 印迹：用一玻璃板横放于盛有20x SSC的搪瓷盘上作为桥，把一张用20x SSC浸润的3MM 的Whatman滤纸铺在玻璃板上，其两端放入瓷盘的20x SSC液体中，用玻璃棒赶尽气泡。

把凝胶（点样孔面朝下）放在滤纸上，避免气泡产生，凝胶周围用胶板封住。

剪一张比凝胶略大的带正电的尼龙膜平铺在凝胶上，避免气泡产生，（使凝胶湿润再放膜）。

再在尼龙膜上放
PCR反应参考程序：
――――――――――――――――时间
Step 1 预变性95-96℃3-8min
Step2 变性94℃50sec
Step3 复性＊50sec
Step4 延伸72℃＊
Step5 2、3、4步骤循环（25次左右）；
Step6 延伸72℃10 min
4℃结束反应（4度长时间保温对PCR仪有较大损伤，一般不超过1小时便及时取出，绝对不允许过夜保温）。

注：
引物应该用专门的软件（如Primer Premier）认真设计，注意两条引物的Tm 值大致相等，GC含量较均一，引物自身以及之间不形成强的二级结构，特别是引物的3’ 端，引物不和模板其他位置形成强的配对（主要看引物3’端）。

MgCl2浓度依不同的模板和引物而定。

MgCl2的浓度对PCR结果影响很大。

链霉菌的PCR因模板的GC含量高，可加DMSO（能降低复性温度）其浓度可在0~10%之间变化。

模板为环形质粒时若一次没有扩增出来，可以考虑先用酶将其切成线性再作。

对高GC含量的模板，预变性的时间也可适当延长，甚至先在沸水中煮5分种，然后迅速放入冰中。

如果使用预变性温度高或时间长，一般要使用“热启动”，即在预变性后再加入酶，这样一是可以保护酶，二是可以避免低温时酶的非特异性扩增。

现在的PCR仪一般都有“热盖”装置，可以代替原来使用的矿物油，避免PCR 过程中水份蒸发到管盖上。

复性温度依引物Tm值及引物与模板的匹配程度而定，提高复性温度可提高扩增的特异性，而当无扩增条带时，可适当降低复性温度。

延伸时间可根据扩增区域的长度确定，扩增区域越长，延伸时间越长。

不同的聚合酶的延伸速度不一样，具体看说明书，一般高保真聚合酶平均每分钟延伸600bp，普通Taq酶每分钟延伸1kb。

根据不同需要使用不同的聚合酶，尤其当用于扩增表达的基因序列时，一定要使用高保真的酶，作普通的PCR验证时就可用普通Taq酶。

以链霉菌或其他高GC含量的DNA作模板时，由于GC含量越高，模板和引物的二级结构越复杂，延伸和配对越难，PCR 反应不好做，可以暂时（2003年7月－）用TaKaRa的La Taq酶作普通的PCR，保真度不敢保证，但扩增效果很好。

酶的用量可参考说明书，并不是越多越好。

LA Taq酶的GC buffer往往能用于别的酶(如普通Taq酶或高保真酶probest)，使它们也能很容易地扩出高G+C的模板来。

PCR重组（详见《PCR技术实验指南》p429 重叠延伸技术）
2. 挑取长好的单菌落接入到装有5ml LB的universal瓶中，摇床过夜培养。

3. 从universal中取1ml过夜培养物，转接于装有20ml LB（用SOC或SOB可提高感受态效率）的250ml三角瓶中，培养2.5~3小时至OD600＝0.6
4. 将培养物倒入50ml已预冷的大离心管中，置于冰上待冷却
5. 离心，4℃.5000rpm.3分钟
6. 倒去上清液，先加少量0.1M CaCl2，打散沉淀，再加10ml，混匀，于冰上放置至少30分或过夜。

7. 离心，4℃.5000rpm.3分钟
8. 弃上清，加1ml 0.1M CaCl2，在冰上轻轻打散沉淀，即可使用。

以上步骤均需注意无菌和低温操作。

DNA转化
1. 取100μl感受态细胞和5μl的酶连产物或1-2ul质粒混合
2. 冰上静置30分钟
3. 42℃热激90秒，然后在冰上放置5min
4. 加0.75ml LB培养基，在37度摇床上培养45分钟。

然后3600转离心2分钟，去掉大部分上清。

（此步不作为快转，作为慢转，慢转可提高效率，有些抗生素如Kan筛选时用慢转较好）
5. 涂布于有抗生素的筛选平板，一般12小时可有转化子出现。

大肠杆菌质粒的快速检测
1. 从转化子平板上挑取单菌落，在另一平板上划小方块，37℃扩大培养12小时
2. 刮取适量（偏少）的菌体悬浮于30μl快检液I溶液中振荡均匀
3. 加入15μl碱性SDS溶液（0.3mol/L NaOH, 2%SDS）（天冷时先使该溶液预热），立即振荡混合完全。

4. 在70℃放置15min（对大于20kb的质粒则最好放在55℃, 30min）水浴时间不宜过长。

5. 冷却至室温，直接上样跑琼脂糖凝胶电泳检测（如果菌体过多，则点样时会发现样品很粘，所以掌握不好时可以在第4步之后加上一部5ul苯酚抽提，离心的步骤。

）
＊如果没有用苯酚处理，看胶时会发现很明显的总DNA的条带，但不影响实验结果的观察。

＊点样时注意点上质粒载体质粒对照，一般在快检时会出现质粒CCC构型的条带，有时也会出现OC构型的。

＊快检液I：0.3M蔗糖，25mM pH8.0 Tris-HCl，0.5mM EDTA，0.02％溴甲酚绿
接合转移（详见英文《手册》249页）
1.带有oriT的目的质粒转化进入大肠杆菌ET12567( pUZ8002),得到转化子;
2. 将转化子的过夜培养物转接在LB中，在合适抗生素下,37 o C培养转化子,到合适浓度
(OD600:0.4-0.6)收集菌体;
3. 用等体积新鲜的LB洗涤菌体两次(洗掉抗生素), 0.1倍体积的LB悬浮.备用;
4. 链霉菌孢子的热激和预萌发（一般的接合转移只须做热激）
(1)新鲜孢子悬浮于5ml 0.05M PH8.0 的TES;
(2)50ºC水浴热激10分钟;
(3)冷却到室温后加入等体积2X孢子预萌发培养基;
(4)37ºC摇床分别培养2-３小时;
（5）离心收集孢子并重新悬浮于适量的水或TES中;
（6）在振荡器上打散孢子
或只作热激按下面步骤：将适量的孢子加入1ml SOC或2倍YT培养基，50度处理10分钟，离心，去大部分上清。

5. 按(1*e-8)：(1*e-9)与3中的大肠杆菌混匀(不一定)
6. 30ºC培养13-20小时左右用适当浓度的抗生素和萘啶酮酸（抑制大肠杆菌）覆盖
6. 30ºC培养数天（一般2天）可得到接合转移子.
7. 挑选接合转移子到含适当抗生素和萘啶酮酸的平板上, 验证;
（作筛选双交换菌株时继续作下面步骤）
8. 直接将得到的接合转移子作影印，寻找单抗的菌株即为双交换菌株。

如果得不到，就要通过单交换菌株的松弛培养来得到双交换菌株。

得到的单交换接合转移子划线
于合适的培养基(含萘啶酮酸，不含别的抗生素)松弛培养;
9. 得到的孢子或菌体稀释涂皿或划单菌落（for Bld菌株）, 影印筛选双交换.
注意事项:
1 不同的孢子热激的温度和时间不同,预培养的时间不同.
2 不同的链霉菌接合转移所用的培养基不同
预萌发培养基
Difco 酵母膏1%
Difco 酪蛋白氨基酸1%
CaCl2 0.1M(需配制5M的原液,分开灭菌后加到酵母膏/酪蛋白氨基酸溶液中去)
链霉菌原生质体的制备
1. 在装有不锈钢弹簧的三角瓶中加入250ml的YEME+TSBY(1:1)(一定要加Glycine)，接种100ul的孢子悬液，于30度摇床中培养36~40 hr（视具体情况，有时培养24h已足够。

）。

2. 将培养物倒入universal中，用无菌水涮洗三角瓶，收集洗液于同一universal中，然后3000 rpm离心10 min。

3. 弃上清，将菌丝体悬浮于15 ml的10.3%的蔗糖溶液中，3000 rpm离心10 min，弃上清。

同此法洗两次。

4. 取1 ml菌丝体，加入4 ml的溶菌酶溶液（溶菌酶母液为50mg/ml P Buffer，终浓度为2 mg/ml，用P Buffer稀释），于30度水浴30~60 min（间隔七八分种轻轻摇动）至上清呈乳状。

5. 加入5 ml的P Buffer并用5 ml的吸管吹吸几次，继续温浴10 min。

（使大量的原生质体释放
出来。

）
6. 用装有脱脂棉的试管过滤，滤液转入无菌干净的universal中，3000 rpm离心7 min（不用brake档防止其破裂）。

原生质体沉淀呈黄色。

7. 弃上清，轻柔打散原生质体，用P Buffer洗两次（洗去溶菌酶）。

每次仍使用3000 rpm离心7 min。

（此步可省略）
8. 弃上清，用枪将原生质体打散，分装，于-70度保存。

注：1.. P缓冲液（原生质体转化用）（Okanishi, 1974）
蔗糖103g，K2SO4 0.25g, MgCl2·6H2O 2.02g, 微量元素溶液2ml，蒸馏水800ml
灭菌后每80ml上述溶液中加入：0.5% KH2PO41ml, 3.68% CaCl2·2H2O 10ml, 5.73% TES 缓冲液(pH7.2) 10ml
2．溶菌时间不能过长，否则会使原生质体破裂。

离心后若看到很粘的絮状物，则说明原生质体破裂。

链霉菌原生质体的转化
1. 将最多5 ul的DNA（质粒或酶连产物）加于已经装有50 ul原生质体的指型管（1.5 ml）的管壁上（不与原生质体接触）。

2. 吸取200ul的25% PEG4000（PEG应先灭菌，再用P Buffer配置），将DNA冲入原生质体中，小心抽吸几次使之混匀。

3. 将混合物涂布于R5平板上（不含任何抗生素）。

4. 30度培养14~20 hr后（待原生质体再生后，即平板呈雾状），用含有适当抗生素的1 ml无菌水溶液覆盖。

5. 再培养1~2 d后，可以看到小的转化子菌落长出。

PCR-Targeting技术中E.coli电转化感受态的制备及电转化
1. 将天蓝色链霉菌库斯质粒转化进入大肠杆菌BW25113/pIJ790*菌株中，此步可用常规的CaCl2法。

（pIJ790带有cat基因和对温度敏感的复制区，培养时温度要严格控制在30゜C以下）
2. 培养含库斯质粒的BW25113/pIJ790菌株：从平板上挑取大肠杆菌单菌落接入5ml 含25ug/ml Cml,100ug/ml Amp的SOB-MgSO4（不加MgCl2 的SOB中加入MgSO4至20mM ）中，30゜C摇床培养过夜。

3. 取一部分过夜培养物至25ml新鲜的SOB-MgSO4培养基（含25ug/ml Cml,100ug/ml Amp）中，菌体终浓度为1% ，添加250ul 1M L-阿拉伯糖诱导λ/red重组系统。

4. 30゜C ，200rpm摇床培养3-5h 至OD600~0.6 。

5. 将培养物倒入预冷的30ml离心管中，冰上置10min(从此细胞温度要保持在0~4゜C)。

4000rpm 4゜C离心5min。

6. 弃掉上清，加1ml预冷的10%甘油，在冰上打散沉淀，再加9ml 10%甘油,摇匀。

7. 4000rpm 4゜C离心5min，弃掉上清，用10%甘油洗涤。

重复上面操作：4000rpm 4゜C离心5min，尽量弃去上清，用残留液将细胞打散。

（感受态细胞浓度越高电转效果越好）
浓缩胶配方如下：
浓缩胶1ml：去离子水0.68ml，1M This-HCl（pH=6.8）0.13ml，30%丙烯酰胺0.17ml，10% SDS 10ul，10%过硫酸胺10ul，TEMED 1ul。

（倒胶前才加入TEMED催化剂）
（5）插上梳子，等胶凝固后，拔掉梳子，如果胶孔里有很多气泡，需要用滤纸剪成小条吸去气泡。

（6）加入电泳缓冲液点样电泳，蛋白在浓缩胶时可以用150V电压，在分离胶时可以用250V 电压，注意观察蛋白的浓缩效果，如果浓缩效果不好说明电泳缓冲液或配胶时的缓冲液用的次数过多，或已经不能用了，电泳缓冲液可用4-5次。

（7）电泳完毕后用染色液染胶至少1小时，脱色2至5小时（根据胶的厚度），其间换脱色液2-3次，可用水继续脱色和短期保存胶，或制备干胶长期保存。

试剂：
30%丙烯酰胺：29g丙烯酰胺，1g N,N’-亚甲双丙烯酰胺，温去离子水定容到100ml（请先在棕色瓶子上做好记号定容，丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺都有毒，要带手套和口罩操作，不要污染量桶）
Tris-Gly电泳缓冲液（5倍，1L）：15.1g Tris，94g Glycine，pH8.3，50ml 10%SDS，去离子水定容。

10%过硫酸胺：0.5g过硫酸胺，去离子水定容到5ml。

4度保存。

（此物容易失活，最好每次少量配置。

胶凝不了，凝的时间长或凝得不充分多半是它的问题。

过硫酸胺在聚合反应过程中提供自由基。

）
脱色液（0.5L）：50ml冰醋酸，225ml甲醇，225ml去离子水。

（甲醇有毒）
（或50ml冰醋酸，235ml 95%乙醇，215ml去离子水。

）（防止挥发，密闭保存。

）
染色液：0.25%（染色效果不好就加大）的考马斯亮蓝溶于脱色液中。

大肠杆菌可溶性蛋白表达及抽提（用于由IPTG诱导的表达体系）：
可溶性蛋白的表达没有固定的方法，对不同的蛋白会有不同的方法，如果抽出的可溶性蛋白不多，可用基本培养基代替LB，用30或25度培养代替37度，IPTG（诱导物）的量也可减少，诱导时间也可变化。

下面的方法仅供参考:
1．将菌接种于5ml LB（含抗生素）培养基中过夜培养，
2．将过夜培养物全部接种到200ml含抗生素的MM培养基中，37度培养4-5小时，加IPTG 至终浓度0.5mM（可变），37度培养13小时。

3．将细胞培养物用20mM的冰冷的Tris-HCl（pH=7.5）浓缩10倍，
4．在冰上用超声波处理（power lever为4-5，duty设为40－50％，60-120次脉冲，每30次脉冲后在冰中放30秒冷却），
5．4度10000rpm离心10分钟,
6．将上清通过0.45um的滤膜（细菌过滤器）
附：MM培养基（1L）
硫酸铵1g，磷酸氢二钾0.5g，7水硫酸镁0.2g，7水硫酸亚铁0.1g
链霉菌总蛋白抽提：
方法一：原生质体法
用作链霉菌原生质体的一般步骤作到用过滤器过滤那一步，后面的操作就和大肠杆菌一样。

方法二：液氮法
1．将摇好或从平板（铺有玻璃纸）上刮下来的菌体放入已经由液氮预冷了的拈砵中，加液氮，用瓷棒将菌体磨成粉状，其间可加一两次液氮。

（摇的菌体需先离心去掉培养基）2．将粉末收集到冰冻过的瓶子中（可-70度保存）
3．直接加pH为7.4（或其他）的20mM Tris-HCl到一定体积
用大肠杆菌的方法加上样液，煮菌体，上样。

（加上样液之前后一定将菌体尽量打散，可防止菌体不能完全破裂，且加入1M的DTT至终浓度50mM防止加热时二硫键的形成。

）
大肠杆菌目标蛋白的诱导及总蛋白检测（含T7表达系统如BL21菌株中的pET系列表达体系）：
诱导蛋白表达：
1．取过夜培养物50ul-200ul接种于5ml含抗生素的Universal瓶中
2．37度摇2小时左右
3．取一定体积的菌液做阴性对照，其余的加IPTG至终浓度为0.2mM（可变）（4ml培养基加80mM的IPTG10ul）
4．37度摇2小时左右
检测蛋白表达：
5．取100ul（或更多）培养物，用pH值为7.4的20mM Tris-HCl（或PBS 7.4）浓缩10倍或5倍。

（菌体多时也可不浓缩）
6．加等体积的2倍上样液（Sampling Buffer），或1／9体积10倍上样液。

（加上样液之前后最好将菌体尽量打散，可防止菌体不能完全破裂，还可加入1M的DTT至终浓度50mM防止加热时二硫键的形成。

）
7．100度煮2-4分钟
8．12000rpm，离心1min（菌体破碎完全时也可不做）
9．取上清点样做SDS-PAGE
部分试剂：
1．蛋白上样buffer(2倍)（10ml）：
SDS 0.2g，溴酚蓝0.0006g，1M Tris-HCl (pH=6.8) 0.8ml，glycerol 1.5ml。

2．蛋白上样buffer(10倍)（10ml）：
SDS 1g，1MTris-HCl (pH=6.8)2.5ml，溴酚蓝0.003g，glycerol 4ml。

3．1M DTT（二硫苏糖醇）
3.09g DTT溶于20ml 0.01mol／l 乙酸钠，过滤除菌，分装，-20度储存。

Western Blot
1. SDS-PAGE
2. 将胶切成所需的大小放入转移缓冲液中15-60分钟。

（胶在不同的缓冲液中会有不同的大小，这一步能让胶的大小达到平衡。

0.7mm的胶只需平衡20分钟左右，1.5mm的胶需平衡40分钟）
3. 将电转夹板平放在桌面上（先垫一层保鲜膜），依次在夹板的一面放上海绵，滤纸，胶（塑料片），膜，滤纸，海绵，关闭夹板。

（所有的东西都要先用转移缓冲液（transfer buffer）浸湿；胶和膜之间不能留有气泡；需要用洁净的玻璃棒从一侧开始把气泡赶走；塑料片放在胶的旁边；蛋白转移一般用硝酸纤维素膜，光的一面朝向胶；滤纸的大小和海绵差不多，膜的大小比胶稍微大一点）
4. 将电转夹板放入电转槽中，有胶的一面朝向负极，电转槽中可放入搅拌子，在电转时搅拌可是缓冲液离子和温度保持均一，电转应在4度（冰箱中）进行，可30V过夜电转或70V电转5小时。

5. 拆开电转夹板，将膜放入洁净的培养皿（7cm）中，用丽春红（Ponceau S）染液染色5分钟，室温，缓慢摇动。

用去离子水脱色数秒钟，倾出去离子水，可以看见蛋白质红色的条带。

（此步可不做，染色并不是很清楚。

）
6. 用TBS润洗膜10分钟，脱去丽春红为止，如果没做第五步，则只需稍微润洗两三次即可，去掉SDS和电转缓冲液。

7. 倒掉所有的TBS，用封闭液（blocking solution）浸泡膜一小时，室温（或4度，过夜），轻轻摇动
8. 用TTBS将膜润洗两三次（不需停留）
9. 将膜泡入含一抗的封闭液中，室温，轻摇2小时
10. 将一抗收集可在4度保存至少1-2周仍然有活性，（含有终浓度为0.02％的叠氮化钠防腐）
11. 重复8
12. 用含二抗的封闭液孵育1小时，收集含二抗的封闭液同步骤10
13. 重复8
14. 加显色液NBT-BCIP（10ml），暗处显色，摇动，5分钟至数小时内可显色好。

试剂：
ponceau S Stain（丽春红染液）：
1ml冰醋酸，0.5g Ponceau S，去离子水100ml
TBS：
150mM NaCl，25mM This-HCl （pH＝7.4）
TTBS：
0.5％Tween-20 in TBS
封闭液（blocking buffer）（约2％）：
2.5g脱脂奶粉用TBS定容到100ml，电炉上加热（用大些的容器防止产生大量气泡），冷却，用玻棒刮去表面的油脂，再加热冷却数次，滤纸过滤，用去离子水定容到100ml。

长期保存需加叠氮化钠至终浓度0.02％。

Transfer Buffer（电转缓冲液）：
300ml甲醇，3.64g Tris Base，21.6g Glycine，去离子水定容到1.5L。