菌种的保藏PPT

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3.1保藏方法
• 暂时保藏法 • 长期保藏法
斜面传代法
穿刺法 液体石蜡法
注意：由于微生物的 多样性，不同的微生 物往往对不同的保藏
甘油管法
方法有不同的适应性，
砂管保藏法 砂土管保藏法 滤纸片保藏法
因此，在具体选择保 藏方法时必须对被保 藏菌株的特性、保藏 物的使用特点及现有
冷冻干燥保藏法 条件等进行综合考虑。
1.1菌种简介
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1.2菌种制备
也称种子制备，是指菌种在一定条件下，经 过扩大培养成为具有一定数量和质量的纯生 产菌种的制备过程。以作接入发酵罐中进一 步扩大菌体量及合成产物之用。
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种子制备包括孢子制备和菌丝体制备（见上图） ，其中(1)～(4)为孢 子制备过程。保存在沙土管或冷冻管中的生产菌种，用无菌手续挑取 少许，接入琼脂斜面培养基上，在25℃（或较高温度）下培养5～7天 (或较长时间)。所得孢子还需进一步用较大表面积的固体培养基以获 得更多孢子，对于霉菌类孢子制备，多数采用大米、小米之类的天然 培养基。将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液，接种到扁瓶固体培养基 上，于25～28℃培养14天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水 分降至10％以下，并放入 4℃冰箱中备用。一次制得的孢子瓶可在生 产上延续使用半年左右。放线菌孢子的培养基大多是采用麸皮或豌豆 浸出液、牛肉膏及无机盐与琼脂制成的。将斜面孢子接入扩大的扁瓶 孢子培养基中,于28～37℃培养5～14天。所获得的大量孢子可直接作 为种子罐 (6)的种子。如果有些生产菌种不产孢子，如赤霉素产生菌 或产孢子不多的,则可采用摇瓶（5）液体培养制得菌丝体，作种子罐 的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发芽、生长、 繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源（如 葡萄糖）和氮源（如玉米浆等）,及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐 (7)的种子应是生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮,无杂菌及异常菌体。 接种量一般在10％～20％。
优点：方法简单、存活率高，具有一定的保藏效果。 缺点：菌种仍有一定的强度的代谢活动条件，保存时间不长，传代多，菌种 容易变异。 适用菌种：细菌、酵母、防线菌、霉菌
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斜面传代保藏法(附图)
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2、矿油（液体石蜡）保藏法
1938年发明。 基本方法和原理：是在斜面培养或穿刺培养上 加一层液体石蜡，液体石蜡可以防止失水干燥， 隔绝空气，降低菌种细胞代谢速率。此法适用 于各类微生物，尤其是不形成芽孢或孢子的真 菌，保藏期限2-10年。 操作方法：矿油灭菌； 菌种培养； 灌 注矿物油 ；低温（5 ℃左右）保藏
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5、液氮冷冻保藏技术
1、选择冷冻保护剂，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和 甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。
2、制备待冷冻保藏菌种悬液，制成孢子及菌体细胞悬液； 0.5～lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶。
3、玻璃安瓿用酒精喷灯封口。
4、以1-2℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温 度之上几度的细胞冻结点(通常为-30℃) 5、将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-)96℃)或 气相(-156℃) 中保存。 6、复苏： 迅速将安瓿置于37-40℃水浴中，并轻轻摇动以加 速解；
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2.1菌种保藏的目的及意义 • 目的 把微生物菌种资源在一定条件下保存，
使其存活、不丢失、不污染杂菌、不发生或少发 生变异，保持菌株原有培养特性和生理活性。
• 意义 菌种是国家的一种重要资源，保持优良
菌种的优良性能，可保证高产稳产；在基础研究 中，菌种保藏可保证研究结果获得良好的重复性
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2.2法律规定
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4、冷冻真空干燥保藏法
首先把加一定保护剂的菌悬液冷冻，然后在冷冻 状态下予以真空干燥，使微生物细胞处于半永久 的休眠状态，从而达到长久保藏的状态。
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冷冻真空干燥操作流程
配制保护剂 灭菌
菌种 培养 制备菌悬液
分装安培瓶 预冻
真空干燥 测定水分 熔封管口 检查真空度
包藏
洗净烘干 装标签 加棉塞
• 2006年3月中华人民共和国农业部发布的《食用 菌菌种管理办法》规定：“农业部主管全国菌种 工作。县级以上地方人民政府农业（食用菌，下 同）行政主管部门负责本行政区域内的菌种管理 工作。”“县级以上地方人民政府农业行政主管 部门应当加强食用菌种质资源保护和良种选育、 生产、更新、推广工作，鼓励选育、生产、经营 相结合。”
菌种的保藏
生产中常用菌种的保藏
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什么是菌种？
目录
菌种保藏意义、基本原理及策略 菌种保藏方法（常见菌种举例） 菌种保藏注意事项及专业机构
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• 用于发酵过程作为活 细胞催化剂的微生物， 包括细菌、放线菌、 酵母菌和霉菌四大类。 来源于自然界大量的 微生物，从中经分离 并筛选出有用菌种， 再加以改良，贮存待 用于生产。
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2.3菌种保藏基本原理及策略
• 原理 采用物理或化学方法使微生物的生命活
动处于半永久性的休眠状态，使微生物的新陈代 谢作用限制在最低的范围内。
菌体变异发生在细胞遗传物质的复制过程中。减少 细胞繁殖次数，可以避免变异的发生。
• 策略 有针对性的创造干燥、低温和隔绝空气的
环境条件，使微生物细胞代谢处于低水平或几乎 停止，是微生物菌种保藏的基本策略。
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3、砂管保藏法
把微生物附着在沙质载体上，置干燥处进行保藏， 适合于保藏放线菌、芽孢细菌和某些真菌。保藏 时间可达几年到几十年。 制备砂管 ： 河砂60目过筛—去杂质漂洗—烘干 分装—灭菌—烘干。 准备菌种：在合适培养基上培养获得孢子。 接种：干法接种，直接将放线菌、真菌孢子接 种于沙管中。湿法接种，先将斜面培养物制成菌 悬液，吸取菌悬液于沙管中（每管约10滴）。 干燥保藏：将含菌沙管放在含干燥剂的干燥器 中吸水干燥。低温或室温下干燥处保藏。
液氮冷冻法
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源自文库
菌 菌种 种保 保藏 藏方 方法 法
生活态 传代培养保藏法
连续在培养基上（内）移种 连续在活宿主上（内）移种
休眠态
湿法
固体斜面 半固体琼脂柱 液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）
干法
藏在玻璃管内 吸附在合适的载体上
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3.2常见几种菌种保藏方法
• 1、斜面传代保藏法
把菌种接种到所需要的斜面培养基上，最适温度 下培养，长出丰满的菌体细胞或孢子后，置于4℃ 的冰箱或冷库中保藏。然后每隔一定时间重新移 接一次，传代保藏。移种时间因菌种不同而异， 几周到几个月不等。