实验细菌的生化鉴定-医学资料
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• 原理：克氏双糖铁（KIA)主要用于革兰阴性 杆菌的鉴别，分解乳糖的细菌斜面为黄色， 分解葡萄糖的细菌底层为黄色，产生硫化 氢的细菌培养基中出现黑色。此外还可以 观察细菌分解葡萄糖是否产气。
克氏双糖铁（KIA）
• 【试剂与器材】 • 1、菌种 大肠埃希菌、变形杆菌 • 2、器材 克氏双糖铁（KIA）、接种针、酒精灯、火柴、
• 大肠杆菌结果：A/A,产气 • 变形杆菌结果：K/A,产大量硫化氢。
吲哚试验
【原理】 吲哚试验又称靛基质试验。某些细菌具
有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸， 生成吲哚、丙酮酸、氨。加入吲哚试剂对 二甲基氨基苯甲醛，与吲哚结合，形成玫 瑰色的吲哚化合物。
吲哚试验
• 【试剂与器材】 • 1．菌种 大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌 • 2．试剂 吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛
灯、火柴、超净工作台
过氧化氢酶试验
• 【操作步骤】 • 1、在载玻片中央滴加一滴3%过氧化氢。 • 2、用无菌移液器吸头蘸取少量细菌，在
3%过氧化氢中混匀。 • 【结果】 观察气泡的产生情况。可以看
见在吸头上金黄色葡萄球菌菌苔周围，产 生大量气泡，为过氧化氢酶阳性。如果菌 苔周围无气泡产生，为过氧化氢酶阴性。
氧化酶试验
• 【试剂与器材】 • 1．菌种 大肠埃希菌、铜绿假单胞菌 • 2．试剂 氧化酶试剂（1%四甲基对苯二
胺） • 3．器材 2cm×2cm滤纸片、污物缸
氧化酶试验
• 【操作步骤】 • 1．将滤纸片叠成四方块状。 • 2．用滤纸片的中心尖角小心刮取大肠埃希
菌菌落，注意不可碰到培养基。 • 3．轻轻展开滤纸片，刮取的菌落正好在滤
乳糖分解利用试验
• 菌种：大肠杆菌、变形杆菌 • 培养基：乳糖发酵管 • 方法： • 1、取2支乳糖发酵管，用记号笔分别标记
大肠杆菌和变形杆菌。 • 2、按细菌的液体接种法，将大肠杆菌和变
形杆菌分别接种到乳糖发酵管中，放入培 养箱中培养18~24h。
乳糖分解利用试验
• 结果观察
乳糖发酵管中含溴甲酚紫指示剂，当 pH值>6.8时 呈紫色，pH值<5.2时呈黄色，当细菌分解利用乳糖，产 酸，使培养基的pH值变小，呈黄色。如细菌不能分解 乳糖，则乳糖发酵管仍为紫色。
过氧化氢酶试验
• 【注意事项】 • 1、普通金属接种环可能与过氧化氢反应，
形成气泡，造成假阳性，因此必须使用铂 丝接种环或塑料、玻璃材质的工具。 • 2、从血液琼脂平板上挑取菌落时千万小心， 不要碰到培养基，因红细胞中有过氧化氢 酶，即使一点点也会造成假阳性。 • 3、过氧化氢试剂现配现用。
克氏双糖铁（KIA）
一、糖（苷、醇）利用试验：
乳糖分解利用试验
• 【原理】
不同的细菌对不同的糖（苷、醇）的分解 能力不同，有的分解，有的不能分解，有 的分解后能产酸产气，有的分解后仅能产 酸，因此可以用来鉴别细菌。
以乳糖分解利用为例，乳糖发酵管中含溴 甲酚紫指示剂，当细菌分解乳糖产酸，培 养基pH下降，指示剂变黄色，不分解乳糖 的指示剂不变色。
品取菌。 • 3．氧化酶试剂要新鲜配制，一般装在棕色瓶中，放在冰
箱中可保存一周，时间长了易被空气氧化变色。 • 4．结果要立刻观察，1min内变色者为阳性，超过1min变
色的为阴性。 • 5．在滤纸片上滴加试剂时不要过多，以刚润湿纸片为宜，
如滤纸片过湿，可能妨碍空气与细菌接触，延长反应时间， 造成假阴性。
1g，95%乙醇95ml，浓盐酸20ml配制） • 3．器材 蛋白胨水培养基、接种针或接种
环、酒精灯、火柴、记号笔、试管架、 37℃恒温培养箱，超净工作台。
常用细菌鉴定技术
实验目的
• 掌握细菌的基本鉴定技术
细菌的基本鉴定技术
• 生化反应鉴定：通过观察细菌利用酶和降 解糖类、醇类、脂类、蛋白质和氨基酸的 能力可以了解其生化活性，从而识别和鉴 定细菌。
• 免疫学鉴定（血清学鉴定） • 编码鉴定
实验内容—生化反应鉴定
（每2人一组）： • 1、糖（苷、醇）利用试验：乳糖分解利用试验 • 2、氧化酶试验 • 3、过氧化氢酶试验 • 4、克氏双糖铁（KIA） • 5、半固体（M）（这个实验已做过，本次不做） • 6、吲哚试验（I） • 7、尿酶试验（U）
接种大肠杆菌的乳糖发酵管变为黄色，接种变形杆 菌的乳糖发酵管仍是紫色。说明大肠杆菌能够分解乳糖 ，变形杆菌不能分解乳糖。
乳糖发酵管中如果有小导管，还可以观察产气情况。 大肠杆菌能够分解利用乳糖，产酸，产气，小导管中有 气泡产生。
氧化酶试验
• 【原理】 氧化酶又称细胞色素氧化酶， 能将还原型细胞色素C氧化形成水和氧化型 细胞色素C，氧化型细胞色素C再使四甲基 对苯二胺氧化，形成显色反应。
纸片中心，滴加一滴1%四甲基对苯二胺。 • 4．立刻观察菌落颜色的变化。 • 5．同法做铜绿假单胞菌的氧化酶试验。
氧化酶试验
• 【结果】 滴加氧化酶试剂后铜绿假单胞菌立 刻变为紫色，为氧化酶阳性。大肠埃希菌不变色， 为氧化酶阴性。
氧化酶试验（左侧为铜绿假单胞菌、右侧为大肠埃希菌）
氧化酶试验
• 【注意事项】 • 1．实验中的菌种要求新培养的，不宜用陈旧的培养物。 • 2．刮取细菌时不可碰到培养基，不可用接种环等金属物
Байду номын сангаас
过氧化氢酶试验
• 【原理】 过氧化氢酶试验又称触酶试验。 部分细菌含有黄素蛋白，在代谢过程中与 空气中的氧发生反应，形成过氧化氢，过 氧化氢对细菌有毒害作用，会破坏细胞组 分，因此，细菌为保护自己，通常具有过 氧化氢酶，可以催化裂解过氧化氢，形成 水和氧气。
过氧化氢酶试验
• 【试剂与器材】 • 1、菌种 金黄色葡萄球菌 • 2、试剂 3%过氧化氢 • 3、器材 载玻片、无菌移液器吸头、酒精
记号笔、试管架、37℃恒温培养箱，超净工作台。 • 【操作步骤】 • 1．取2支克氏双糖铁（KIA），用记号笔分别标记大肠埃
希菌、变形杆菌。 • 2．按细菌的斜面接种法，将大肠埃希菌、变形杆菌分别
接种到相应的管中。 • 3．放入培养箱中培养18~24h。
克氏双糖铁（KIA）
• 结果观察：观察上部和下部的颜色变化， 变黄为产酸，变红为产碱，有气泡为产气， 有黑色为产硫化氢。
克氏双糖铁（KIA）
• 【试剂与器材】 • 1、菌种 大肠埃希菌、变形杆菌 • 2、器材 克氏双糖铁（KIA）、接种针、酒精灯、火柴、
• 大肠杆菌结果：A/A,产气 • 变形杆菌结果：K/A,产大量硫化氢。
吲哚试验
【原理】 吲哚试验又称靛基质试验。某些细菌具
有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸， 生成吲哚、丙酮酸、氨。加入吲哚试剂对 二甲基氨基苯甲醛，与吲哚结合，形成玫 瑰色的吲哚化合物。
吲哚试验
• 【试剂与器材】 • 1．菌种 大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌 • 2．试剂 吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛
灯、火柴、超净工作台
过氧化氢酶试验
• 【操作步骤】 • 1、在载玻片中央滴加一滴3%过氧化氢。 • 2、用无菌移液器吸头蘸取少量细菌，在
3%过氧化氢中混匀。 • 【结果】 观察气泡的产生情况。可以看
见在吸头上金黄色葡萄球菌菌苔周围，产 生大量气泡，为过氧化氢酶阳性。如果菌 苔周围无气泡产生，为过氧化氢酶阴性。
氧化酶试验
• 【试剂与器材】 • 1．菌种 大肠埃希菌、铜绿假单胞菌 • 2．试剂 氧化酶试剂（1%四甲基对苯二
胺） • 3．器材 2cm×2cm滤纸片、污物缸
氧化酶试验
• 【操作步骤】 • 1．将滤纸片叠成四方块状。 • 2．用滤纸片的中心尖角小心刮取大肠埃希
菌菌落，注意不可碰到培养基。 • 3．轻轻展开滤纸片，刮取的菌落正好在滤
乳糖分解利用试验
• 菌种：大肠杆菌、变形杆菌 • 培养基：乳糖发酵管 • 方法： • 1、取2支乳糖发酵管，用记号笔分别标记
大肠杆菌和变形杆菌。 • 2、按细菌的液体接种法，将大肠杆菌和变
形杆菌分别接种到乳糖发酵管中，放入培 养箱中培养18~24h。
乳糖分解利用试验
• 结果观察
乳糖发酵管中含溴甲酚紫指示剂，当 pH值>6.8时 呈紫色，pH值<5.2时呈黄色，当细菌分解利用乳糖，产 酸，使培养基的pH值变小，呈黄色。如细菌不能分解 乳糖，则乳糖发酵管仍为紫色。
过氧化氢酶试验
• 【注意事项】 • 1、普通金属接种环可能与过氧化氢反应，
形成气泡，造成假阳性，因此必须使用铂 丝接种环或塑料、玻璃材质的工具。 • 2、从血液琼脂平板上挑取菌落时千万小心， 不要碰到培养基，因红细胞中有过氧化氢 酶，即使一点点也会造成假阳性。 • 3、过氧化氢试剂现配现用。
克氏双糖铁（KIA）
一、糖（苷、醇）利用试验：
乳糖分解利用试验
• 【原理】
不同的细菌对不同的糖（苷、醇）的分解 能力不同，有的分解，有的不能分解，有 的分解后能产酸产气，有的分解后仅能产 酸，因此可以用来鉴别细菌。
以乳糖分解利用为例，乳糖发酵管中含溴 甲酚紫指示剂，当细菌分解乳糖产酸，培 养基pH下降，指示剂变黄色，不分解乳糖 的指示剂不变色。
品取菌。 • 3．氧化酶试剂要新鲜配制，一般装在棕色瓶中，放在冰
箱中可保存一周，时间长了易被空气氧化变色。 • 4．结果要立刻观察，1min内变色者为阳性，超过1min变
色的为阴性。 • 5．在滤纸片上滴加试剂时不要过多，以刚润湿纸片为宜，
如滤纸片过湿，可能妨碍空气与细菌接触，延长反应时间， 造成假阴性。
1g，95%乙醇95ml，浓盐酸20ml配制） • 3．器材 蛋白胨水培养基、接种针或接种
环、酒精灯、火柴、记号笔、试管架、 37℃恒温培养箱，超净工作台。
常用细菌鉴定技术
实验目的
• 掌握细菌的基本鉴定技术
细菌的基本鉴定技术
• 生化反应鉴定：通过观察细菌利用酶和降 解糖类、醇类、脂类、蛋白质和氨基酸的 能力可以了解其生化活性，从而识别和鉴 定细菌。
• 免疫学鉴定（血清学鉴定） • 编码鉴定
实验内容—生化反应鉴定
（每2人一组）： • 1、糖（苷、醇）利用试验：乳糖分解利用试验 • 2、氧化酶试验 • 3、过氧化氢酶试验 • 4、克氏双糖铁（KIA） • 5、半固体（M）（这个实验已做过，本次不做） • 6、吲哚试验（I） • 7、尿酶试验（U）
接种大肠杆菌的乳糖发酵管变为黄色，接种变形杆 菌的乳糖发酵管仍是紫色。说明大肠杆菌能够分解乳糖 ，变形杆菌不能分解乳糖。
乳糖发酵管中如果有小导管，还可以观察产气情况。 大肠杆菌能够分解利用乳糖，产酸，产气，小导管中有 气泡产生。
氧化酶试验
• 【原理】 氧化酶又称细胞色素氧化酶， 能将还原型细胞色素C氧化形成水和氧化型 细胞色素C，氧化型细胞色素C再使四甲基 对苯二胺氧化，形成显色反应。
纸片中心，滴加一滴1%四甲基对苯二胺。 • 4．立刻观察菌落颜色的变化。 • 5．同法做铜绿假单胞菌的氧化酶试验。
氧化酶试验
• 【结果】 滴加氧化酶试剂后铜绿假单胞菌立 刻变为紫色，为氧化酶阳性。大肠埃希菌不变色， 为氧化酶阴性。
氧化酶试验（左侧为铜绿假单胞菌、右侧为大肠埃希菌）
氧化酶试验
• 【注意事项】 • 1．实验中的菌种要求新培养的，不宜用陈旧的培养物。 • 2．刮取细菌时不可碰到培养基，不可用接种环等金属物
Байду номын сангаас
过氧化氢酶试验
• 【原理】 过氧化氢酶试验又称触酶试验。 部分细菌含有黄素蛋白，在代谢过程中与 空气中的氧发生反应，形成过氧化氢，过 氧化氢对细菌有毒害作用，会破坏细胞组 分，因此，细菌为保护自己，通常具有过 氧化氢酶，可以催化裂解过氧化氢，形成 水和氧气。
过氧化氢酶试验
• 【试剂与器材】 • 1、菌种 金黄色葡萄球菌 • 2、试剂 3%过氧化氢 • 3、器材 载玻片、无菌移液器吸头、酒精
记号笔、试管架、37℃恒温培养箱，超净工作台。 • 【操作步骤】 • 1．取2支克氏双糖铁（KIA），用记号笔分别标记大肠埃
希菌、变形杆菌。 • 2．按细菌的斜面接种法，将大肠埃希菌、变形杆菌分别
接种到相应的管中。 • 3．放入培养箱中培养18~24h。
克氏双糖铁（KIA）
• 结果观察：观察上部和下部的颜色变化， 变黄为产酸，变红为产碱，有气泡为产气， 有黑色为产硫化氢。