分子生物学实验指导

分子生物学实验指导动植物检疫专业

2012，2

分子生物学实验注意事项

1．课前要提早预习实验内容，了解实验设计的原理，理清实验顺序，制定实验方案（没有方案或方案不合理者不能进入实验操作）。

2．由于实验内容多，时刻短，多数实验需要同时或穿插进行，一定要做好统筹安排。

3．实验课中的所有单项实验都属于一个整体流程。实验时刻安排上没有上下午晚上等严格的作息安排，一切服从实验进度，必须在理论课上课期间完成。

4．实验的每一步都要详细地记录操作内容、时刻、步骤、结果等，以备查询！

5．对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（专门是微量移液器！）。在操作的过程中发觉任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。

6．写作实验报告或实验论文一定要文理通顺、逻辑清晰、图表讲明详细，讨论分析透彻。

7．在实验室内不能大声喧哗。

8．在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），严禁随地丢弃！专门注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。

9．实验终止后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验实。

10．值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。

11．实验时损坏的任何物品都要及时申报。

实验一质粒DNA的提取

1．目的

学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。

2．原理

按照共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.012.5那个狭窄的范畴内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH 复原中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，通过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。

3．器材

超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。

4．试剂

pMD18-T-F载体菌，LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液I），NaOH/SDS溶液(溶液II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液III)，RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8. 0）。

5．实验预备

氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20C储存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200mL d d water 搅拌完全溶解，用约200L 5N NaOH调pH至7.0，加dd water 至1L，121 C 20min灭菌）；溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）；溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）；溶液III（60mL 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补dd water至100ml），7

0%乙醇（-20C储存），TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0）；10mg /mL RNase A（RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中）；摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121 C 30m in）。

6．操作步骤

（1）在超净工作台中取5ml LB（Amp+），加入灭菌的摇菌管中。

（2）从超低温冰箱中取出储存pMD-18T-F的菌种（操作完后迅速把菌种放回超低温冰柜中，切不可将菌融解！），在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于无菌LB培养液（含100ug/ml氨苄青霉素）中搅拌一下，37C摇床中摇20h。

（3）取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，15000rpm离心1min，弃上清液（尽量弃洁净），留沉淀备用。

（4）在沉淀中加入100l 溶液I，盖上盖后赶忙在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（等待的同时，取一个塑料盒，装上适量的冰块备用。）

（5）加入200l 溶液II，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。

（6）加入150l 溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。

（7）15000rpm离心5min，小心吸取400l 上清液于另一个洁净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！），加入800l 95% 乙醇，盖上盖后赶忙在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。

（8）15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，加入500l 70%乙醇，盖上盖后赶忙在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃洁净

（9）再加入500l 70% 乙醇，盖上盖后赶忙在涡旋混合器上混匀。1 5000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃洁净

（10）离心管倒置于37C培养箱中（或室温）空气干燥。（管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎看不见！）。

（11）pMD18-T-F 加入30l 无菌蒸馏水或TE缓冲液，用记号笔标记后放入冰箱中备用。

（12）在剩余的菌液中倒入少许84消毒液，待溶液变清亮后随废液和剩余的冰块一起倒入下水池。清理桌面，清洗仪器，撰写实验报告7．摸索

（1）阻碍本实验结果的因素有哪些？

实验二、质粒DNA的酶切

1．目的

学会用限制性内切酶切割质粒DNA。

2．原理

II型限制性内切酶能识别双链DNA内部的专门序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电用酶切后的DNA混合物能够确认和分离酶切片段。

3．器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，水漂，恒温水浴。