抗幽门螺杆菌HP1188蛋黄抗体的研究

·基础实验研究论著·

抗幽门螺杆菌ＨＰ１１８８蛋黄抗体的研究＊

韩　飞１，杨致邦２△，王长本１，李建英１，周　政１，牟君成１

（１．重庆三峡中心医院微生物免疫科，重庆４０４０００；

２．重庆医科大学基础医学院病原生物学教研室，重庆４０００１６）

摘　要：目的　制备抗幽门螺杆菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）ＨＰ１１８８蛋黄抗体（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｙｏｌｋ，ＩｇＹ），即ＨＰ１１８８－ＩｇＹ，了解其理化特性和生物学活性，为研制Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ　ＨＰ１１８８－ＩｇＹ型抗体口服制剂提供实验依据。方法　用纯化的重组ＨＰ１１８８蛋白免疫产蛋鸡，以水稀释法结合氯仿有机沉淀法提取蛋黄抗体（ＨＰ１１８８－ＩｇＹ），采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测其纯度，Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白含量，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析抗原特异性。间接ＥＬＩＳＡ评价ＨＰ１１８８－ＩｇＹ对热、酸及胃蛋白酶消化作用的耐受情况。分别检测不同浓度ＨＰ１１８８－ＩｇＹ及不同ｐＨ相同浓度ＨＰ１１８８－ＩｇＹ对Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ的生长抑制试验。用ＭＴＴ法检测不同浓度ＨＰ１１８８－ＩｇＹ对Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ细胞毒活性的中和作用。结果　ＨＰ１１８８－ＩｇＹ纯度约为６８％，蛋白浓度为７．７９ｍｇ／ｍＬ，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ结果显示在相对分子质量３０　０００附近出现反应条带。ＨＰ１１８８－ＩｇＹ具有一定的耐热性、耐酸性和耐胃蛋白酶消化的能力。ＨＰ１１８８－ＩｇＹ在体外可抑制Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ生长，并具有浓度依赖性和ｐＨ依赖性。ＨＰ１１８８－ＩｇＹ能阻断Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌体蛋白对Ｈｅｌａ细胞的毒性作用，且该作用具有浓度依赖性。结论　成功制备了ＨＰ１１８８－ＩｇＹ，其具有良好的理化性质和生物学特性，为进一步制备预防幽门螺杆菌感染的口服制剂奠定了基础。

关键词：螺杆菌，幽门；　黏附素；　ＨＰ１１８８蛋白；　蛋黄抗体；　体外试验

ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－４１３０．２０１３．０４．００３文献标识码：Ａ文章编号：１６７３－４１３０（２０１３）０４－０３９０－０３

Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｙｏｌｋ　ａｇａｉｎｓｔ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＨＰ１１８８　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ＊

Ｈａｎ　Ｆｅｉ１，Ｙａｎｇ　Ｚｈｉｂａｎｇ２△，Ｗａｎｇ　Ｃｈａｎｇｂｅｎ１，Ｌｉ　Ｊｉａｎｙｉｎｇ１，Ｚｈｏｕ　Ｚｈｅｎｇ１，Ｍｏｕ　Ｊｕｎｃｈｅｎｇ１（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　Ｔｈｒｅｅ　Ｇｏｒｇｅｓ　Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０４０００，Ｃｈｉｎａ；

２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０００１６，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ＨＰ１１８８－ＩｇＹ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｙｏｌｋ　ｏｆ　ｈｅｎ′ｓｅｇｇ　ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＨＰ１１８８ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）ａｎｄ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｒａｌ　ａｄｍｉｎ－ｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ＨＰ１１８８－ＩｇＹ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ＨＰ１１８８ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｍｍｕｎｉｚｅ　ｈｅｎｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ＨＰ１１８８－ＩｇＹ　ｗａｓ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍｔｈｅ　ｙｏｌｋ　ｂｙ　ｗａｔｅｒ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ　ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｔｈｅ　ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆ　ＨＰ１１８８－ＩｇＹ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，ｂｒａｄｆｏｒｄｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ．Ｔｈｅ　ｉｎｄｉｒｅｃｔ　ＥＬＩＳＡ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｈｅａｔ－ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ａｃｉｄ－ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｐｅｐｓｉｎ－ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ＨＰ１１８８－ＩｇＹ．Ｔｈｅ　ＨＰ１１８８－ＩｇＹ　ｉｎ　ｃｅｒｔａｉｎ　ｐＨ　ａｎｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ａｄｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｌｉｑｕｉｄ　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｎｌｙ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｓｏｍｅ　ｔｉｍｅ　ｉｎ３７℃ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｌ　ＨＰ１１８８－ＩｇＹ　ｉｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ　ｇｒｏｗｔｈ．ＭＴＴ　ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏａｓｓａｙ　ｔｈｅ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨＰ１１８８－ＩｇＹ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｔｙ　ｏｆ　Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆ　ＨＰ１１８８－ＩｇＹ　ｗａｓ　ａｂｏｕｔ　６８％，ａｎｄ　ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｗａｓ　７．７９ｍｇ／ｍＬ．Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂａｎｄｓ　ｗｉｔｈ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ　３０　０００．Ｔｈｅ　ＨＰ１１８８－ＩｇＹｓｈｏｗｅｄ　ａ　ｗｅｌｌ　ｈｅａｔ－ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ａ　ｆａｖｏｒａｂｌｅ　ａｃｉｄ－ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ａ　ｇｏｏｄ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ａｎｔｉ－ｐｅｐｓｉｎ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．ＨＰ１１８８－ＩｇＹ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈｏｆ　Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ　ａｎｄ　ｐＨ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ　ｂｌｏｃｋｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ＨＰ１１８８－ＩｇＹ．Ｔｈｅ　ＨＰ１１８８－ＩｇＹ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｄ　ｔｈｅ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｔｙ　ｏｆ　Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ　ｉｎ　ａ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ＨＰ１１８８－ＩｇＹ　ｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ｗｉｔｈ　ｇｏｏｄ　ｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ　ａｎｄ　ｗｅｌｌ　ｂｉｏｌｏｇｉｃ　ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ．Ｉｔ　ｍｉｇｈｔ　ｐｌａｙ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｐｒｅｐａｒｉｎｇ　ｏｒａｌｐｒｏｄｕｃｔ　ｔｏ　ｐｒｅｖｅｎｔ　ｔｈｅ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ．

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ；　ａｄｈｅｓｉｎ；　ＨＰ１１８８ｐｒｏｔｅｉｎ；　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｙｏｌｋ；　ｖｉｔｒｏ

幽门螺杆菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ，Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）感染及其引起的相关疾病越来越受关注，对该菌感染的防治已成为当前研究的热点［１－３］。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ表面的黏附素是其黏附在胃黏膜引起感染的先决条件。ＨＰ１１８８蛋白是２００５年Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ－Ｄｕｎｌｏｐ等［４］利用镍珠模型法从Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ中筛选到一种新的黏附素蛋白。该蛋白的特点是：（１）存在于所有Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌株表面，表达量高；（２）编码基因为Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ所特有且高度保守，与已知的黏附素序列无同源性；（３）有黏附功能，免疫原性强，能持续刺激机体免疫应答，符合理想保护性抗原的要求。目前抗生素治疗Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ引起的感染存在不足［５］：（１）耐药菌株的产生；（２）易复发和再感染；（３）不良反应较强和医疗费用较高；（４）无法达到群体防治的效果，无法有效控制Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ的传播和感染。因此寻找抗菌药物替代疗法具有重要的现实意义。鉴于胃癌、胃溃疡均属消化道疾病，因此，通过食品加以预防意义重大。自从１８９３年有研究者发现鸡蛋中存在抗体以来，蛋黄抗体（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｙｏｌｋ，ＩｇＹ）技术正成为医药领域的新热点，它适于生产特异性抗体，具有开发功能性食品和新药的潜能［６］。近年来，国内外许多研究已经证实口服特异性ＩｇＹ可通过被动免疫有效防治消化道感染性疾病［７－８］，现在已有许多学者将其制成口服制剂以防治龋齿、轮状病毒引起的腹泻和其他胃肠道感染性疾病，并取得满意效果。本研究用Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ重组ＨＰ１１８８蛋白免疫产蛋鸡制备ＨＰ１１８８－ＩｇＹ，初步探讨了

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·国际检验医学杂志２０１３年２月第３４卷第４期　Ｉｎｔ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｍｅｄ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ　２０１３，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．４

＊基金项目：重庆市万州区科委项目（２０１２０３００６）。　作者简介：韩飞，女，主管检验师，主要从事机会致病菌感染与免疫研究。　△　通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｒｙａｎｇｆｍ３６５＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。