酶免疫技术课件
合集下载
《酶免疫分析技术》课件
生物工程
酶免疫分析技术在生物工程中广泛应用，如蛋 白质表达、酶催化反应和抗体筛选等。
优点与局限
1 优点
酶免疫分析技术具有高灵敏度、高特异性、 广泛适应性和操作简便等优点。
2 局限
酶免疫分析技术的局限主要包括影响因素较 多、标记物抗原性和稳定性的要求高等限制。
总结
《酶免疫分析技术》是一种重要的生物分析方法，其原理和应用领域广泛。通过本课件的学习，我们对酶免疫 分析技术有了更深入的了解，并了解到其优点和局限。谢谢大家的聆听！
为什么选择酶作为标记物？
酶具有活性强、稳定性好、催化效率高等特点，可以产生放大效应，大幅提高测定的灵敏度。
酶免疫分析技术的发展历程
酶免疫分析技术自20世纪70年代初提出以来，经过不断创新和发展，已成为生物医学和环 境检测领域的重要分析方法。
酶免疫分析技术的原理
酶底物反应原理
酶标记的免疫试剂与待检测物结 合后，通过酶底物的催化反应产 生可检测的信号，如颜色、发光 或电流。
《酶免疫分析技术》PPT 课件
这是一份《酶免疫分析技术》的PPT课件，通过本课件，我们将深入介绍酶 免疫分析技术的原理、主要实现步骤、应用、优点与局限等内容。让我们开 始学习吧！
绪论
什么是酶免疫分析技术？
酶免疫分析技术是一种高灵敏度、高特异性的生物分析方法，通过酶标记的免疫试剂与待检 测物发生特异性反应，再利用酶对底物的催化作用产生信号。
3
信号产生
通过酶底物反应或其他方式，产生与待检测物浓度相关的可检测信号。
酶免疫分析技术的应用
医学诊断
酶免疫分析技术在临床医学中广泛应用，如血 液病、感染性疾病和肿瘤标志物的检测。
环境监测
酶免疫分析技术可用于水质、土壤和空气中有 害物质的监测，对环境污染的快速筛查具有重 要意义。
酶免疫分析技术在生物工程中广泛应用，如蛋 白质表达、酶催化反应和抗体筛选等。
优点与局限
1 优点
酶免疫分析技术具有高灵敏度、高特异性、 广泛适应性和操作简便等优点。
2 局限
酶免疫分析技术的局限主要包括影响因素较 多、标记物抗原性和稳定性的要求高等限制。
总结
《酶免疫分析技术》是一种重要的生物分析方法，其原理和应用领域广泛。通过本课件的学习，我们对酶免疫 分析技术有了更深入的了解，并了解到其优点和局限。谢谢大家的聆听！
为什么选择酶作为标记物？
酶具有活性强、稳定性好、催化效率高等特点，可以产生放大效应，大幅提高测定的灵敏度。
酶免疫分析技术的发展历程
酶免疫分析技术自20世纪70年代初提出以来，经过不断创新和发展，已成为生物医学和环 境检测领域的重要分析方法。
酶免疫分析技术的原理
酶底物反应原理
酶标记的免疫试剂与待检测物结 合后，通过酶底物的催化反应产 生可检测的信号，如颜色、发光 或电流。
《酶免疫分析技术》PPT 课件
这是一份《酶免疫分析技术》的PPT课件，通过本课件，我们将深入介绍酶 免疫分析技术的原理、主要实现步骤、应用、优点与局限等内容。让我们开 始学习吧！
绪论
什么是酶免疫分析技术？
酶免疫分析技术是一种高灵敏度、高特异性的生物分析方法，通过酶标记的免疫试剂与待检 测物发生特异性反应，再利用酶对底物的催化作用产生信号。
3
信号产生
通过酶底物反应或其他方式，产生与待检测物浓度相关的可检测信号。
酶免疫分析技术的应用
医学诊断
酶免疫分析技术在临床医学中广泛应用，如血 液病、感染性疾病和肿瘤标志物的检测。
环境监测
酶免疫分析技术可用于水质、土壤和空气中有 害物质的监测，对环境污染的快速筛查具有重 要意义。
酶免疫测定技术PPT课件
测食品中的残留农药：迄今为止，应用ELISA检测食品中的残留农药主要是除 草剂、杀菌剂和杀虫剂。ELISA 法测定农药残留以其特异性强、灵敏度高及 快速准确而得到广泛的应用，尤其是现场控制水果、蔬菜、食品中的农药残 留，对发展无污染农产品，保障人体健康起到积极作用。
检测食品中的微生物：制备单克隆抗体分析食品中伤寒沙门氏菌，结果准确 可靠，比常规方法缩短了 3~4ｄ，而且与其它沙门氏菌交叉反应率很低，与 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌无交叉反应。
ELISA广泛应用于内分泌、血液、肿瘤、传染病、免疫化学等方面， 例如：用于检测雌性激素、胰岛素等，检查凝血因子、红细胞抗原等； 用于检查甲胎蛋白，其敏感性已达到放射免疫试验相当的水平。
ELISA在抗体检测中优势突出，尤其对病毒检测明显优于常规检测方 法。例如：对流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒、狂犬病毒和脊髓灰 质炎病毒等的检测。同时用作自身免疫病抗体测定以及对过敏的诊断， 例如检测过敏原的抗体。
编辑版ppt
18
一、治疗药物监测一药物血浓度测定 有地高辛、奎尼丁、利多卡因、双异丙、普鲁卡因酞胺、
N 一乙酞普鲁卡因酞胺(前者的有活性代谢物)、庆大霉素、 妥布霉素、丁胺卡那霉素、乙基西梭霉素、氨甲喋吟等。 二、药物滥用的尿检验— 半定量分析 有苯丙胺、巴比妥类、苯甲二氮草类、大麻类、可卡因、 乙醇、美沙酮、安眠酮、阿片类 、丙氧吩等。半定量分 析是以阴性、低、中等三种浓度的标准品为三点制作一条 标准曲线, 测定样品的光吸收值变化率与标准曲线比较, 可以计算样本中存在的药物与代谢物总量。 三、血清三环类抗抑郁药的定性分析 阿米替林、去甲替林、丙咪啧、去甲丙咪嗦、氯丙咪嗦、 三甲丙咪嗓、多虑平、普鲁替林等及其4 种代谢物。 定性分析是应用一个一定浓度的标准品作对照, 如样品的 光吸收值变化率超过标准品, 即为阳性;否则算作阴性。据 此可作快速毒物鉴定。 四、血清巴比妥类及苯甲二氮草类的半定量分析 7 种巴比妥类及13 种苯甲二氮草类药物的半定量分析。 测定方法亦系以阴性、低、编辑版中ppt等三种浓度的标准品作对照19 比较, 以测算样本中存在的药物量。
检测食品中的微生物：制备单克隆抗体分析食品中伤寒沙门氏菌，结果准确 可靠，比常规方法缩短了 3~4ｄ，而且与其它沙门氏菌交叉反应率很低，与 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌无交叉反应。
ELISA广泛应用于内分泌、血液、肿瘤、传染病、免疫化学等方面， 例如：用于检测雌性激素、胰岛素等，检查凝血因子、红细胞抗原等； 用于检查甲胎蛋白，其敏感性已达到放射免疫试验相当的水平。
ELISA在抗体检测中优势突出，尤其对病毒检测明显优于常规检测方 法。例如：对流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒、狂犬病毒和脊髓灰 质炎病毒等的检测。同时用作自身免疫病抗体测定以及对过敏的诊断， 例如检测过敏原的抗体。
编辑版ppt
18
一、治疗药物监测一药物血浓度测定 有地高辛、奎尼丁、利多卡因、双异丙、普鲁卡因酞胺、
N 一乙酞普鲁卡因酞胺(前者的有活性代谢物)、庆大霉素、 妥布霉素、丁胺卡那霉素、乙基西梭霉素、氨甲喋吟等。 二、药物滥用的尿检验— 半定量分析 有苯丙胺、巴比妥类、苯甲二氮草类、大麻类、可卡因、 乙醇、美沙酮、安眠酮、阿片类 、丙氧吩等。半定量分 析是以阴性、低、中等三种浓度的标准品为三点制作一条 标准曲线, 测定样品的光吸收值变化率与标准曲线比较, 可以计算样本中存在的药物与代谢物总量。 三、血清三环类抗抑郁药的定性分析 阿米替林、去甲替林、丙咪啧、去甲丙咪嗦、氯丙咪嗦、 三甲丙咪嗓、多虑平、普鲁替林等及其4 种代谢物。 定性分析是应用一个一定浓度的标准品作对照, 如样品的 光吸收值变化率超过标准品, 即为阳性;否则算作阴性。据 此可作快速毒物鉴定。 四、血清巴比妥类及苯甲二氮草类的半定量分析 7 种巴比妥类及13 种苯甲二氮草类药物的半定量分析。 测定方法亦系以阴性、低、编辑版中ppt等三种浓度的标准品作对照19 比较, 以测算样本中存在的药物量。
酶免疫术课件共19页
Ab
★洗涤、封闭
★加待测标本（Ag）+酶标Ag
★洗涤
★加底物显色
五、膜载体的酶免疫测定
一）斑点酶免疫吸附试验（dot-ELISA） 二）斑点免疫渗滤试验（IFA） 三）斑点免疫层析试验（ICA） 四）免疫印迹法（IBT）-Western-blot
六、酶免疫组织化学技术
▪
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
▪
29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
▪
30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
19
酶免疫术件
酶免疫技术
一、定义 二、分类
酶免疫组织化学技术
酶免疫测定 均相酶免疫测定
异相酶免疫测定 液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
三、常用的酶及底物
常用酶
底物
辣根过氧化物酶 邻苯二胺、H2O2
（HRP）
四甲基联苯胺、 H2O2
碱性磷酸酶（AP） 对硝基本磷酸脂
显色 橙黄色
蓝色 黄色
四、酶联免疫吸附试验
（enzyme linked immunosorbent assay，ELASA） 一）基本原理
二）技术类型
1、间接法
包被抗原 洗涤 封闭 待测标本 洗涤 加酶标二抗 洗涤 底物显色
2、双抗体夹心法
★包被：
Ab
★洗涤、封闭
★加待测标本：Ag
★洗涤
★加酶标抗体
第八章+酶免疫技术-88页精选文档
技术要点 同双抗体夹心法。
双抗原夹心法检测抗体
固相抗体
标本（含抗体）
E
底物
E
酶标抗原
E
双抗原夹心法测抗体
E EE E EE
（+）
E EE
（-）
3.竞争法检测抗体
1．原理 同竞争法结合抗原。
HBcAb和HBeAb的测定均采用竞争法，但其 测定具体模式有区别。
2．技术要点
（1）竞争法检测HBcAb： ①将HBcAg包被于固相反应板上，洗涤。 ②加入待检标本和酶标特异性抗体，温育，洗涤。 ③加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色 仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含 量成反比。
• 酶标抗体（抗原） 与抗原（抗体）的 特异性反应
• 酶对底物的显色反 应
• 对抗原或抗体进行 定位、定性或定量 的测定分析
酶高效催化反 应的专一性
+
抗原抗体反应 的特异性
第一节 酶免疫技术的特点
基本原理
• 酶标抗体（抗原）
抗原
底物
与抗原（抗体）的 特异性反应
酶标抗体
E
E
E
• 酶对底物的显色反
应
• 对抗原或抗体进行 定位、定性或定量 的测定分析
第三节 酶联免疫吸附试验（ELISA）
一、基本原理
1 包被
将已知抗原或抗
体吸附在固相载 体表面
2 反应
加入待测抗体或 抗原和酶标抗原
或抗体
洗涤
3使结合在固相上
的抗原抗体复合物 与未结合的分离
底物显色
4 定性或定量的分析
二、方法类型及反应原理
（一）检测抗原的方法 1.双抗体夹心法
将己知抗体包被固相载体，待检标本中的相 应抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合 成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成 固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，根据加底物后 的显色程度确定待检抗原的含量。
双抗原夹心法检测抗体
固相抗体
标本（含抗体）
E
底物
E
酶标抗原
E
双抗原夹心法测抗体
E EE E EE
（+）
E EE
（-）
3.竞争法检测抗体
1．原理 同竞争法结合抗原。
HBcAb和HBeAb的测定均采用竞争法，但其 测定具体模式有区别。
2．技术要点
（1）竞争法检测HBcAb： ①将HBcAg包被于固相反应板上，洗涤。 ②加入待检标本和酶标特异性抗体，温育，洗涤。 ③加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色 仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含 量成反比。
• 酶标抗体（抗原） 与抗原（抗体）的 特异性反应
• 酶对底物的显色反 应
• 对抗原或抗体进行 定位、定性或定量 的测定分析
酶高效催化反 应的专一性
+
抗原抗体反应 的特异性
第一节 酶免疫技术的特点
基本原理
• 酶标抗体（抗原）
抗原
底物
与抗原（抗体）的 特异性反应
酶标抗体
E
E
E
• 酶对底物的显色反
应
• 对抗原或抗体进行 定位、定性或定量 的测定分析
第三节 酶联免疫吸附试验（ELISA）
一、基本原理
1 包被
将已知抗原或抗
体吸附在固相载 体表面
2 反应
加入待测抗体或 抗原和酶标抗原
或抗体
洗涤
3使结合在固相上
的抗原抗体复合物 与未结合的分离
底物显色
4 定性或定量的分析
二、方法类型及反应原理
（一）检测抗原的方法 1.双抗体夹心法
将己知抗体包被固相载体，待检标本中的相 应抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合 成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成 固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，根据加底物后 的显色程度确定待检抗原的含量。
免疫酶技术 ppt课件
2.用金标记免疫法（斑点免疫 层析试验）检测HCG的原理
(酶免疫测定法)
固相载体 聚苯乙烯
Ag 或 Ab 吸 附 到 固 相 载体上的过程,称为 包被
实验中所需酶标抗体的制备方法 同荧光抗体制备：
纯化后的抗体+酶 透析去除游 离酶 测定酶标抗体工作浓度
试验中有关术语及试剂：
包被(coat)：将Ag或Ab吸附在固相
载体上的过程，又称固相化或吸附。包被后， 不能被洗脱。包被缓冲液：PH9.6 CB
（二）酶标光度仪检测A492值
（吸光率）：比色法
1.与阳性、阴性对照测定值比较 2.P/N比值：大于2.0为阳性，小于2.0 为阴性
P: positive（待测吸光度值） N: negative
四.ELISA试验的影响因素
（一）固相载体
常用固相载体材料：聚苯乙烯。其特点为吸 附Ag或Ab的能力强，一但吸附后，不能被洗脱。
缺点:
1.影响因素多,多方把关 2.偶有假阳性、假阴性
六.膜载体的酶免疫测定
（一） 斑点-ELISA
特点:
1. 固相载体为硝酸纤维素膜 2.酶促反应后在膜上形成有色沉淀物
固相Ag
（二）免疫印迹法
(immunoblotting test,IBT)
七. 应 用 (包括所有标记技术)
(一)病原体的诊断及研究
固相载体：酶标板 可分软、硬板 一次性使用，不可回收
酶标板要求：
•吸附性能好、空白值低、透明度高 •板批间、孔间性能相近
（二）抗原、抗体
Ag：需纯化 Ab：需效价高、亲和力强、纯化
（三）试验条件
1.包被：
一般用pH 9.6 CB(carbonate buffer)，0.05M, 有利于蛋白质吸附
(酶免疫测定法)
固相载体 聚苯乙烯
Ag 或 Ab 吸 附 到 固 相 载体上的过程,称为 包被
实验中所需酶标抗体的制备方法 同荧光抗体制备：
纯化后的抗体+酶 透析去除游 离酶 测定酶标抗体工作浓度
试验中有关术语及试剂：
包被(coat)：将Ag或Ab吸附在固相
载体上的过程，又称固相化或吸附。包被后， 不能被洗脱。包被缓冲液：PH9.6 CB
（二）酶标光度仪检测A492值
（吸光率）：比色法
1.与阳性、阴性对照测定值比较 2.P/N比值：大于2.0为阳性，小于2.0 为阴性
P: positive（待测吸光度值） N: negative
四.ELISA试验的影响因素
（一）固相载体
常用固相载体材料：聚苯乙烯。其特点为吸 附Ag或Ab的能力强，一但吸附后，不能被洗脱。
缺点:
1.影响因素多,多方把关 2.偶有假阳性、假阴性
六.膜载体的酶免疫测定
（一） 斑点-ELISA
特点:
1. 固相载体为硝酸纤维素膜 2.酶促反应后在膜上形成有色沉淀物
固相Ag
（二）免疫印迹法
(immunoblotting test,IBT)
七. 应 用 (包括所有标记技术)
(一)病原体的诊断及研究
固相载体：酶标板 可分软、硬板 一次性使用，不可回收
酶标板要求：
•吸附性能好、空白值低、透明度高 •板批间、孔间性能相近
（二）抗原、抗体
Ag：需纯化 Ab：需效价高、亲和力强、纯化
（三）试验条件
1.包被：
一般用pH 9.6 CB(carbonate buffer)，0.05M, 有利于蛋白质吸附
酶联免疫吸附实验ppt课件
作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通 过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。 3、若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后 重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。 4、试剂盒灵敏度：最小可测人TNF-a达4pg/ml。
19
20
第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤 液350μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸 水纸上拍干，洗4次。
23
工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
16
第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。
19
20
第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤 液350μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸 水纸上拍干，洗4次。
23
工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
16
第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。
临床免疫学检验-课件-第9章 酶免疫技术1
• 酶标记物的标记原则
• 保有酶的催化活性和抗体（或抗原）的活性。 • 结合物有良好的稳定性。 • 标记方法简单、产率高、且重复性好。
制备酶结合物的方法
戊二醛交联法：以双功能交联剂为“桥”，分别 与酶和抗体（抗原）连接而形成结合物。
要求：交联剂至少含有两个可与蛋白质分子通过化 学反应而结合的反应基团。
HRP催化TMB
HRP催化
– 终止反应； –提高显色的稳定性，退色慢！以TMB为例
不加终止液：2小时内反应产物退色，蓝色产物 在450nm有最大吸收峰，但峰值较低
加终止液：反应产物变成黄色，在450nm处具有 最大吸收峰，峰值比蓝色产物峰值高。
–不同显色体系里可能使用的终止液不同（酸或碱）。
– 定义：通过化学反应将酶与抗体或抗原形成结合物 – 作用：酶免疫测定技术的核心组成部分，它的稳定性
决定EIA试剂盒的有效使用日期。
（一）酶标记抗体或抗原的制备 （p50）
• 抗原和抗体的要求：
• 抗原：纯度高，抗原性完整; • 抗体：效价高、亲和力强、特异性强，能批量生产，易于分
离纯化。常用单克隆抗体
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）： β-半乳糖苷酶（β-galactosidase, β-Gal）
辣根过氧化酶（HRP）
• HRP的性质: • 主酶（糖蛋白）+ 辅基（亚铁血红素）蔬菜作物辣根中含 量很高。 • 最高吸收峰:主酶(275nm)与酶活性无关；辅基(403nm)酶活 性基团
• HRP的纯度： • 纯度数(Reinheit zahl, RZ)表示：A403/A275 • 用于标记的HRP, RZ ≥ 3.0。 • 仅表示辅基在HRP中的含量，RZ越大不意味着酶活性越高， 酶变性后RZ不变但活性降低 。
• 保有酶的催化活性和抗体（或抗原）的活性。 • 结合物有良好的稳定性。 • 标记方法简单、产率高、且重复性好。
制备酶结合物的方法
戊二醛交联法：以双功能交联剂为“桥”，分别 与酶和抗体（抗原）连接而形成结合物。
要求：交联剂至少含有两个可与蛋白质分子通过化 学反应而结合的反应基团。
HRP催化TMB
HRP催化
– 终止反应； –提高显色的稳定性，退色慢！以TMB为例
不加终止液：2小时内反应产物退色，蓝色产物 在450nm有最大吸收峰，但峰值较低
加终止液：反应产物变成黄色，在450nm处具有 最大吸收峰，峰值比蓝色产物峰值高。
–不同显色体系里可能使用的终止液不同（酸或碱）。
– 定义：通过化学反应将酶与抗体或抗原形成结合物 – 作用：酶免疫测定技术的核心组成部分，它的稳定性
决定EIA试剂盒的有效使用日期。
（一）酶标记抗体或抗原的制备 （p50）
• 抗原和抗体的要求：
• 抗原：纯度高，抗原性完整; • 抗体：效价高、亲和力强、特异性强，能批量生产，易于分
离纯化。常用单克隆抗体
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）： β-半乳糖苷酶（β-galactosidase, β-Gal）
辣根过氧化酶（HRP）
• HRP的性质: • 主酶（糖蛋白）+ 辅基（亚铁血红素）蔬菜作物辣根中含 量很高。 • 最高吸收峰:主酶(275nm)与酶活性无关；辅基(403nm)酶活 性基团
• HRP的纯度： • 纯度数(Reinheit zahl, RZ)表示：A403/A275 • 用于标记的HRP, RZ ≥ 3.0。 • 仅表示辅基在HRP中的含量，RZ越大不意味着酶活性越高， 酶变性后RZ不变但活性降低 。
《酶联免疫分析法》课件
酶联免疫分析法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。
酶联免疫分析法广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。
分类：直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法等 应用：临床诊断、药物研发、食品安全检测、环境监测等领域 优点：灵敏度高、特异性强、操作简便、成本低等 局限性：存在假阳性和假阴性结果，需要标准化操作和严格的质量控制
汇报人：PPT
PPT,a click to unlimited possibilities
汇报人：PPT
CONTENTS
PART ONE
PART TWO
酶联免疫分析法（ELISA）是一种免疫学检测方法，用于检测样品中的抗原或抗体。
原理：利用抗原-抗体特异性结合的原理，通过酶催化底物产生颜色反应，从而定量或定性检测样品中的抗原或 抗体。
优点：灵敏度高，特异性强，检测速度快，操作简便 缺点：成本较高，需要专业人员操作，容易受到环境因素影响
PART THREE
抗原选择：选择合适的抗原，如蛋 白质、多肽等
抗原标记：将抗原与酶或荧光素等 标记物结合
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
抗原纯化：通过离心、层析等方法 纯化抗原
抗原保存：将标记好的抗原保存在 适当的条件下，如低温、避光等
检测水中有机污染物：如农药、多 环芳烃等
检测土壤中的污染物：如重金属、 有机氯农药等
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
检测空气中的污染物：如二氧化硫、 氮氧化物等
检测生物体内的污染物：如农药残 留、重金属等
蛋白质定量分析：通过酶联免疫分析法检测蛋白质的浓度 抗体检测：通过酶联免疫分析法检测抗体的存在和浓度 细胞因子检测：通过酶联免疫分析法检测细胞因子的存在和浓度 基因表达分析：通过酶联免疫分析法检测基因的表达水平和调控机制
酶联免疫分析法广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。
分类：直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法等 应用：临床诊断、药物研发、食品安全检测、环境监测等领域 优点：灵敏度高、特异性强、操作简便、成本低等 局限性：存在假阳性和假阴性结果，需要标准化操作和严格的质量控制
汇报人：PPT
PPT,a click to unlimited possibilities
汇报人：PPT
CONTENTS
PART ONE
PART TWO
酶联免疫分析法（ELISA）是一种免疫学检测方法，用于检测样品中的抗原或抗体。
原理：利用抗原-抗体特异性结合的原理，通过酶催化底物产生颜色反应，从而定量或定性检测样品中的抗原或 抗体。
优点：灵敏度高，特异性强，检测速度快，操作简便 缺点：成本较高，需要专业人员操作，容易受到环境因素影响
PART THREE
抗原选择：选择合适的抗原，如蛋 白质、多肽等
抗原标记：将抗原与酶或荧光素等 标记物结合
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
抗原纯化：通过离心、层析等方法 纯化抗原
抗原保存：将标记好的抗原保存在 适当的条件下，如低温、避光等
检测水中有机污染物：如农药、多 环芳烃等
检测土壤中的污染物：如重金属、 有机氯农药等
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
检测空气中的污染物：如二氧化硫、 氮氧化物等
检测生物体内的污染物：如农药残 留、重金属等
蛋白质定量分析：通过酶联免疫分析法检测蛋白质的浓度 抗体检测：通过酶联免疫分析法检测抗体的存在和浓度 细胞因子检测：通过酶联免疫分析法检测细胞因子的存在和浓度 基因表达分析：通过酶联免疫分析法检测基因的表达水平和调控机制
《酶免疫技术》PPT课件
酶作用后，生成高强度 荧光物 ，用荧光计 测 量。
精品医学
13
二、酶标记抗体或抗原
酶免疫技术的核心组成部分
酶结合物 （conjugate）
酶标记物
通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的
结合物
精品医学
14
酶标记抗体或抗原
制备方法要求
➢抗原要求纯度高，抗原性完整
➢抗体需要特异性好、效价高、亲 合力强以及比活性较高，能批量生 产，易纯化。
精品医学
7
酶和酶作用底物
常用酶
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心
RZ值与酶活性无关， 酶活性单位比RZ值 更为重要
辣根过氧化物酶（HRP）
RZ值：403nm （辅基） 与275nm（主酶） OD值之比
精品医学
ELISA中应用最为广 泛的标记用酶
8
酶和酶作用底物
抗原和酶标抗原
或抗体
洗涤
3
使结合在固相上
的抗原抗体复合物
与未结合的分离
4 底物显色
定性或定量的分析
精品医学
31
二、方法类型及反应原理
三个必要试剂
固相的抗原或抗体
酶标记物（酶结合物）
酶反应的底物
精品医学
32
ELISA检测抗原的方法
双抗体夹心法
➢ 方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶
标抗体，加底物显色
4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色
+
捕获法精原品医理学
EE E
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合
临床检验免疫学酶免疫技术课件
常用的供氢体(底物）： 邻苯二胺（O-phenylenediamine, OPD）:反应显橙黄
色，应避光，致癌性 四甲基联苯胺（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB）:
反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差 ABTS (2,2'-azino-di-(3- ethylbenziazobine sulfonate-6)
反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的 酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非标记 Ag（Ab）的浓度成反比
四）捕获法(capture ELISA )：
主要用于 血清中某种抗体亚型成分的测定 检测IgM抗体最常用方法
原理：
（三) 结果分析：
1、定性
• 间接法与夹心法：正相关 竞争法：反相关
4℃过夜
弃包被液，PBS清洗
保存备用。
三）封闭(blocking)
1、定义：包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被 的过程
2、常用的封闭剂：1％～5％牛血清白蛋白
二、酶免疫技术分类
Ag-E + Ab E-Ag Ab + Ag-E
EE
E
E
三、酶联免疫吸附试验
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
待测抗原或抗体量与产物量呈负相关
基本原理
测定抗原:
测定抗体
特点：
用于抗原和半抗原的定性、定量测定，也可对 抗体进行测定
酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag （Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力
反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab）是 固定限量的，且前者的结合位点少于酶标记与 非标记Ag（Ab）的分子数量和
色，应避光，致癌性 四甲基联苯胺（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB）:
反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差 ABTS (2,2'-azino-di-(3- ethylbenziazobine sulfonate-6)
反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的 酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非标记 Ag（Ab）的浓度成反比
四）捕获法(capture ELISA )：
主要用于 血清中某种抗体亚型成分的测定 检测IgM抗体最常用方法
原理：
（三) 结果分析：
1、定性
• 间接法与夹心法：正相关 竞争法：反相关
4℃过夜
弃包被液，PBS清洗
保存备用。
三）封闭(blocking)
1、定义：包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被 的过程
2、常用的封闭剂：1％～5％牛血清白蛋白
二、酶免疫技术分类
Ag-E + Ab E-Ag Ab + Ag-E
EE
E
E
三、酶联免疫吸附试验
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
待测抗原或抗体量与产物量呈负相关
基本原理
测定抗原:
测定抗体
特点：
用于抗原和半抗原的定性、定量测定，也可对 抗体进行测定
酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag （Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力
反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab）是 固定限量的，且前者的结合位点少于酶标记与 非标记Ag（Ab）的分子数量和
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
二）技术类型
1、间接法
包被抗原 洗涤 封闭 待测标本 洗涤 加酶标二抗 洗涤 底物显色
2、双抗体夹心法
★包被：
Ab
★洗涤、封闭
★加待测标本：Ag
★洗涤
★加酶标抗体
★洗涤
★加底物显色
3、竞争法
★包被：
Ab
★洗涤、封闭
★加待测标本（Ag）+酶标Ag
★洗涤
★加底物显色
五、膜载体的酶免疫测定
酶免疫技术
一、定义 二、分类
酶免疫组织化学技术
酶免疫测定 均相酶免疫测定
异相酶免疫测定 液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
三、常用的酶及底物
常用酶
底物
辣根过氧化物酶 邻苯、 H2O2
碱性磷酸酶（AP） 对硝基本磷酸脂
显色 橙黄色
蓝色 黄色
四、酶联免疫吸附试验
（enzyme linked immunosorbent assay，ELASA） 一）基本原理
一）斑点酶免疫吸附试验（dot-ELISA） 二）斑点免疫渗滤试验（IFA） 三）斑点免疫层析试验（ICA） 四）免疫印迹法（IBT）-Western-blot
六、酶免疫组织化学技术
1、间接法
包被抗原 洗涤 封闭 待测标本 洗涤 加酶标二抗 洗涤 底物显色
2、双抗体夹心法
★包被：
Ab
★洗涤、封闭
★加待测标本：Ag
★洗涤
★加酶标抗体
★洗涤
★加底物显色
3、竞争法
★包被：
Ab
★洗涤、封闭
★加待测标本（Ag）+酶标Ag
★洗涤
★加底物显色
五、膜载体的酶免疫测定
酶免疫技术
一、定义 二、分类
酶免疫组织化学技术
酶免疫测定 均相酶免疫测定
异相酶免疫测定 液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
三、常用的酶及底物
常用酶
底物
辣根过氧化物酶 邻苯、 H2O2
碱性磷酸酶（AP） 对硝基本磷酸脂
显色 橙黄色
蓝色 黄色
四、酶联免疫吸附试验
（enzyme linked immunosorbent assay，ELASA） 一）基本原理
一）斑点酶免疫吸附试验（dot-ELISA） 二）斑点免疫渗滤试验（IFA） 三）斑点免疫层析试验（ICA） 四）免疫印迹法（IBT）-Western-blot
六、酶免疫组织化学技术