酶免疫技术优秀课件
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3、加酶标抗体 无抗原结合
4、加酶作用的
-
不产生颜
ELISA检测抗原的方法
竞争法
方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗 原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。
应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药
物、激素等）
1、已知抗体包 被于载体表面
克隆酶供体免疫分析 CEDIA
cloned enzyme donor immunoassay
EMIT示意图
CEDIA示意图
二、非均相酶免疫测定
与均相不同 之处
需分离游离与结合的酶标记物
➢ 分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸 附试验（ELISA） 是目前最为常用的固相酶免 疫测定
标抗体，加底物显色
➢ 应用：
二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等
E
E EE
1、已知抗体包 被于载体表面
2、加待检物
抗原与抗体结合
E
3、加酶标抗体
与抗原结合
E
4、加酶作用的底物
+
产生颜色
双抗体夹心法测抗原
E EE
1、已知抗体 被于载体表 2、加待检物无 原与抗体结
封闭 blocking
用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小 牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消 除非特异性吸附
第二节 酶免疫技术分类
酶
酶免疫组化 组织切片或其它标本中抗原的定位
免
疫
均相
技
术 酶免疫测定
液体标本中抗原或 抗体的定性和定量
固相酶免疫测定
非均相
液相酶免疫测定
一、均相酶免疫测定
➢固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将 游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用 方法
固相载体
要求
•结合抗体或抗原的容量大 •抗体或抗原牢固地固定在其表面 •不影响免疫反应性 •利Βιβλιοθήκη Baidu反应充分进行 •固相方法简便易行，快速经济
种类
•塑料制品 •微颗粒 •膜载体
包被与封闭
包被 coating
将抗原或抗体结合于固相载体
菌源性AP 肠粘膜AP
β–半乳糖苷酶（β-Gal）
用于均相酶 免疫测定
酶和酶作用底物
常用底物
HRP的底物
HR DH2+H2O2P→ → → D+2H2O
H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很 高
供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种
酶和酶作用底物
常用底物
邻苯二胺 OPD
四甲基联苯胺 TMB HRP的常见底物
用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定
原理 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标
记酶的活性会发生改变，不用分离结合和 游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的 改变，而确定抗原或抗体的含量。
均相酶免疫测定
最具代表性的两种技术
酶放大免疫测定技术EMIT
enzyme-mutiplied immunoassay technique
酶免疫技术优秀课件
第一节 酶免疫技术的特点
原理及特点
抗原抗体反应的特异性
+
酶高效催化反应的专一性
• 主要试剂: 酶标记的抗体或抗原
• 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性
原理及特点
原理：
➢酶标抗体（抗原）与抗原 （抗体）的特异性反应
➢酶对底物的显色反应
➢对抗原或抗体进行定位、 定性或定量的测定分析
第三节 酶联免疫吸附试验
一、基本原理
原理
1
包被
洗涤
3
使结合在固相上
的抗原抗体复合物
与未结合的分离
2
反应
加入待测抗体或
抗原和酶标抗原
或抗体
4 底物显色
定性或定量的分析
二、方法类型及反应原理
三个必要试剂
固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物）
酶反应的底物
ELISA检测抗原的方法
双抗体夹心法
➢ 方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶
酶标记物稳定 ，不形成聚合物
酶标记抗体或抗原
制备方法
过碘酸钠法（直接法）
常用于HRP标记抗体或抗原
戊二醛交联法
酶标记抗体或抗原
戊二醛交联法
戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别 与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法 有一步法和二步法。二步法标记效率比一 步法高，酶标记物质量较均一。
酶标记抗体或抗原
AP的 底物
酶和酶作用底物
常用底物
对-硝基苯磷酸酯 （ pNPP ）
经AP作用后的产物为黄色对 硝基酚，最大吸收峰波长为 405 nm。
β-Gal 的底物
4-甲基伞酮基β-D 半-乳糖苷 （ 4MUG ）
酶作用后，生成高强度 荧光物 ，用荧光计 测 量。
二、酶标记抗体或抗原
酶免疫技术的核心组成部分
5-氨基水杨酸5-ASA
2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑 啉磺酸-6)铵盐 ABTS
酶和酶作用底物
HRP的常见底物
OPD反应后显橙 黄色，加酸终止 反应后呈棕黄色， 测定波长492nm。 不稳定，致癌性。
TMB反应后显蓝色 ， 加酸终止反应后变 为黄色,测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性，ELISA中 应用最广泛的底物。
特点：
➢灵敏度高、特异性强、 准确性好 ➢酶标记试剂能够较长时 间保持稳定 ➢操作简便、对环境没有 污染。 ➢易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的
新方法。
一、酶和酶作用底物
标记酶的要求：
活性高 性质稳定 专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉
纯化及鉴定
标记完成后应除去反应液中的游离酶、 游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体 或抗原聚合物，避免游离酶增加非特 异显色，以及游离抗体或抗原起竞争 作用而降低特异性染色强度
常用的纯化方法：
葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯 化
50%饱和硫酸铵沉淀提纯
三、固相载体
➢固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合 到固相载体的表面
酶结合物 （conjugate）
酶标记物
通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的
结合物
酶标记抗体或抗原
制备方法要求
➢抗原要求纯度高，抗原性完整 ➢抗体需要特异性好、效价高、亲 合力强以及比活性较高，能批量生 产，易纯化。
酶标记抗体或抗原
制备方法要求
技术方法简单、产率高，重复性 好
标记反应不影响酶和抗原或抗体 的活性
酶和酶作用底物
常用酶
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心
RZ值与酶活性无关， 酶活性单位比RZ值 更为重要
辣根过氧化物酶（HRP）
RZ值：403nm （辅基） 与275nm（主酶） OD值之比
ELISA中应用最为广 泛的标记用酶
酶和酶作用底物
常用酶
碱性磷酸酶（AP）
4、加酶作用的
-
不产生颜
ELISA检测抗原的方法
竞争法
方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗 原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。
应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药
物、激素等）
1、已知抗体包 被于载体表面
克隆酶供体免疫分析 CEDIA
cloned enzyme donor immunoassay
EMIT示意图
CEDIA示意图
二、非均相酶免疫测定
与均相不同 之处
需分离游离与结合的酶标记物
➢ 分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸 附试验（ELISA） 是目前最为常用的固相酶免 疫测定
标抗体，加底物显色
➢ 应用：
二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等
E
E EE
1、已知抗体包 被于载体表面
2、加待检物
抗原与抗体结合
E
3、加酶标抗体
与抗原结合
E
4、加酶作用的底物
+
产生颜色
双抗体夹心法测抗原
E EE
1、已知抗体 被于载体表 2、加待检物无 原与抗体结
封闭 blocking
用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小 牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消 除非特异性吸附
第二节 酶免疫技术分类
酶
酶免疫组化 组织切片或其它标本中抗原的定位
免
疫
均相
技
术 酶免疫测定
液体标本中抗原或 抗体的定性和定量
固相酶免疫测定
非均相
液相酶免疫测定
一、均相酶免疫测定
➢固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将 游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用 方法
固相载体
要求
•结合抗体或抗原的容量大 •抗体或抗原牢固地固定在其表面 •不影响免疫反应性 •利Βιβλιοθήκη Baidu反应充分进行 •固相方法简便易行，快速经济
种类
•塑料制品 •微颗粒 •膜载体
包被与封闭
包被 coating
将抗原或抗体结合于固相载体
菌源性AP 肠粘膜AP
β–半乳糖苷酶（β-Gal）
用于均相酶 免疫测定
酶和酶作用底物
常用底物
HRP的底物
HR DH2+H2O2P→ → → D+2H2O
H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很 高
供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种
酶和酶作用底物
常用底物
邻苯二胺 OPD
四甲基联苯胺 TMB HRP的常见底物
用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定
原理 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标
记酶的活性会发生改变，不用分离结合和 游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的 改变，而确定抗原或抗体的含量。
均相酶免疫测定
最具代表性的两种技术
酶放大免疫测定技术EMIT
enzyme-mutiplied immunoassay technique
酶免疫技术优秀课件
第一节 酶免疫技术的特点
原理及特点
抗原抗体反应的特异性
+
酶高效催化反应的专一性
• 主要试剂: 酶标记的抗体或抗原
• 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性
原理及特点
原理：
➢酶标抗体（抗原）与抗原 （抗体）的特异性反应
➢酶对底物的显色反应
➢对抗原或抗体进行定位、 定性或定量的测定分析
第三节 酶联免疫吸附试验
一、基本原理
原理
1
包被
洗涤
3
使结合在固相上
的抗原抗体复合物
与未结合的分离
2
反应
加入待测抗体或
抗原和酶标抗原
或抗体
4 底物显色
定性或定量的分析
二、方法类型及反应原理
三个必要试剂
固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物）
酶反应的底物
ELISA检测抗原的方法
双抗体夹心法
➢ 方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶
酶标记物稳定 ，不形成聚合物
酶标记抗体或抗原
制备方法
过碘酸钠法（直接法）
常用于HRP标记抗体或抗原
戊二醛交联法
酶标记抗体或抗原
戊二醛交联法
戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别 与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法 有一步法和二步法。二步法标记效率比一 步法高，酶标记物质量较均一。
酶标记抗体或抗原
AP的 底物
酶和酶作用底物
常用底物
对-硝基苯磷酸酯 （ pNPP ）
经AP作用后的产物为黄色对 硝基酚，最大吸收峰波长为 405 nm。
β-Gal 的底物
4-甲基伞酮基β-D 半-乳糖苷 （ 4MUG ）
酶作用后，生成高强度 荧光物 ，用荧光计 测 量。
二、酶标记抗体或抗原
酶免疫技术的核心组成部分
5-氨基水杨酸5-ASA
2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑 啉磺酸-6)铵盐 ABTS
酶和酶作用底物
HRP的常见底物
OPD反应后显橙 黄色，加酸终止 反应后呈棕黄色， 测定波长492nm。 不稳定，致癌性。
TMB反应后显蓝色 ， 加酸终止反应后变 为黄色,测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性，ELISA中 应用最广泛的底物。
特点：
➢灵敏度高、特异性强、 准确性好 ➢酶标记试剂能够较长时 间保持稳定 ➢操作简便、对环境没有 污染。 ➢易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的
新方法。
一、酶和酶作用底物
标记酶的要求：
活性高 性质稳定 专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉
纯化及鉴定
标记完成后应除去反应液中的游离酶、 游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体 或抗原聚合物，避免游离酶增加非特 异显色，以及游离抗体或抗原起竞争 作用而降低特异性染色强度
常用的纯化方法：
葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯 化
50%饱和硫酸铵沉淀提纯
三、固相载体
➢固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合 到固相载体的表面
酶结合物 （conjugate）
酶标记物
通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的
结合物
酶标记抗体或抗原
制备方法要求
➢抗原要求纯度高，抗原性完整 ➢抗体需要特异性好、效价高、亲 合力强以及比活性较高，能批量生 产，易纯化。
酶标记抗体或抗原
制备方法要求
技术方法简单、产率高，重复性 好
标记反应不影响酶和抗原或抗体 的活性
酶和酶作用底物
常用酶
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心
RZ值与酶活性无关， 酶活性单位比RZ值 更为重要
辣根过氧化物酶（HRP）
RZ值：403nm （辅基） 与275nm（主酶） OD值之比
ELISA中应用最为广 泛的标记用酶
酶和酶作用底物
常用酶
碱性磷酸酶（AP）