酵母菌基因工程
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基因工程
1 基因工程概论 2 基因工程的基本原理 3 基因工程所需的基本条件 4 基因工程的操作过程 5 目的基因的克隆与基因文库的构建 6 大肠杆菌基因工程 7 酵母基因工程 8 哺乳动物基因工程 9 高等植物基因工程 10 外源基因表达产物的分离纯化
7 酵母基因工程
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 B 酵母菌的宿主系统 C 酵母菌的载体系统 D 酵母菌的转化系统 E 酵母菌的表达系统 F 利用重组酵母生产乙肝疫苗
7 酵母基因工程
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 酵母菌表达外源基因的优势
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚， 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国 认定为安全 基因工程受体系统（ 的 基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS 酵母菌是最简单的真核模式生物 ）
RAF STB REP1 IR FLP
A ori IR 同源重组
REP2
酵母菌中的野生型质粒
乳酸克鲁维酵母中的线状质粒
乳酸克鲁维酵母中含有两种不同 的双链线状质粒pGKL1和pGKL2 和 的双链线状质粒 拷贝数为50-100个，分别携带K1 拷贝数为 个 分别携带
反向重复序列 pGKL1 8.9 kb DNA聚合酶 毒素蛋白αβ 免疫蛋白 γ 亚基 聚合酶 毒素蛋白αβ
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有CEN的YCp质粒的构建 的 含有 质粒的构建
CEN为酵母菌染色体 为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列 为酵母菌染色体 上与染色体均匀分配有关的序列 将CEN DNA插入含 插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为 的质粒中， 插入含 的质粒中 获得的新载体称为YCp YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1 - 5个 质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有 质粒具有较高的有丝分裂稳定性 个
ubiquitin ligase E3 靶蛋白
Lys
蛋白酶体
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因
酵母菌共有四个泛素编码基因： 酵母菌共有四个泛素编码基因：
UBI 1 编码泛素-羧基延伸蛋白 （CEP52） 对数生长期表达 稳定期关闭 编码泛素 羧基延伸蛋白52（ 羧基延伸蛋白 ） UBI 2 编码泛素-羧基延伸蛋白 （CEP52） 对数生长期表达 稳定期关闭 编码泛素 羧基延伸蛋白52（ 羧基延伸蛋白 ） UBI 3 编码泛素-羧基延伸蛋白 （CEP76） 对数生长期表达 稳定期关闭 编码泛素 羧基延伸蛋白76（ 羧基延伸蛋白 ） UBI 4 编码泛素五聚体 对数生长期关闭 稳定期表达
7 酵母基因工程
C 酵母菌的载体系统
酵母菌中的野生型质粒 酵母菌克隆表达质粒的构建
酵母菌中的野生型质粒
酿酒酵母中的2µ环状质粒
几乎所有的酿酒酵母中都含有2µ 几乎所有的酿酒酵母中都含有 µ双链 环状质粒，拷贝数达50至100个。 环状质粒，拷贝数达 至 个 IRs 反向重复序列，600 bp，重组 反向重复序列， ， FLP 编码产物驱动IRs的同源重组 的同源重组 编码产物驱动 REP 编码产物控制质粒的稳定性 STB REP的结合位点 的结合位点 接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及 和 接合酵母属中的 ， 克鲁维酵母属中的pKD1等均与 µ质 等均与2µ 克鲁维酵母属中的 等均与 粒类似。 粒类似。 B
其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽， 其中酿酒酵母பைடு நூலகம்遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵 表达外源基因最理想。 表 表达外源基因最理想。 母达外源基因最理想
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型
突变类型 生物效应 改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达 作用位点 钙离子依赖型的ATP酶 酶 钙离子依赖型的 转录后加工 转录水平 转录水平 羧肽酶Y 羧肽酶 转录水平
酵母菌共有七个泛素连接酶基因： 酵母菌共有七个泛素连接酶基因：
UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7 、 、 、 、 、 、
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素降解途径衰减的酿酒酵母
UBI 4缺陷型： 缺陷型： 缺陷型 在酿酒酵母菌中，泛素主要由 基因表达， 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能 基因表达 正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多， 正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多， 因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体 因此 缺陷突变株是外源基因表达理想的受体 UBA 1缺陷型： 缺陷型： 缺陷型 UBA1编码泛素激活酶 ，UBA1突变株是致死性的，但其等位 编码泛素激活酶E1， 突变株是致死性的， 编码泛素激活酶 突变株是致死性的 基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解 基因缺陷是非致死性的， Ubc4 - ubc5 双突变型： 双突变型： 七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效
ssc1 ssc2 rgr1 ose1 ssc11 rho-
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团， 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团， 影响蛋白质的生物活性。 它们常常影响蛋白质的生物活性 它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖 链两部分组成。 链两部分组成。 酵母菌普遍拥有蛋白 质的糖基化系统，但野生 质的糖基化系统， 型酿酒酵母对异源蛋白的 糖基化反应很难控制，呈 糖基化反应很难控制， 超糖基化倾向，因此超糖 超糖基化倾向， 基化缺陷株非常重要。 基化缺陷株非常重要。
克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 如乳酸克鲁维酵母（ ） 毕赤酵母属 裂殖酵母属 汉逊酵母属 如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 如巴斯德毕赤酵母（ ） 如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） 如非洲酒裂殖酵母（ ） 如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha） 如多态汉逊酵母（ ）
酵母菌的转化程序
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、 ）、PEG、热休克 酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（ 、 处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有下列特性： 处理后，也可高效吸收质粒 ，而且具有下列特性： 吸收线型DNA的能力明显大于环状 的能力明显大于环状DNA，两者相差 倍 吸收线型 的能力明显大于环状 ，两者相差80倍 共转化现象极为罕见
7 酵母基因工程
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 酵母菌的分类学特征
酵母菌（ 芽殖或 方式进行无性繁殖 酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细 ）是一群以芽殖 裂殖方式进行无性繁殖的单细 胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵 真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（ 子囊菌纲 ）、担子菌纲 母）、半知菌类（半知酵母菌），共由 个属和 半知菌类（ ），共由 个属和500多个种组成。如 多个种组成。 菌）、半知菌类 半知酵母菌），共由56个属和 多个种组成 果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统， 果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是 最 成熟的真核生物表达系统。 成熟的真核生物表达系统。
K2两种能使多种酵母菌致死的毒 两种能使多种酵母菌致死的毒 素蛋白编码基因（α β γ），同时含有毒素蛋白抗性基因。 γ），同时含有毒素蛋白抗性基因。 ），同时含有毒素蛋白抗性基因 素蛋白编码基因（
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有ARS的YRp质粒的构建 的 含有 质粒的构建
ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每 为酵母菌中的自主复制序列， 为酵母菌中的自主复制序列 ，染色体上每30-40kb 就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标 元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、 就有一个 元件 记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。 记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒 。 为复制子的质粒称为YRp 以ARS为复制子的质粒称为 为复制子的质粒称为 以2µ质粒上的复制元件为复制子的质粒称为 µ质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养几代 个 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达 后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。 质粒的丢失率高达 ，主要是由于分配不均匀所致。
突变类型 生物效应 甘露糖生物合成缺陷型 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型 外侧糖链添加缺陷型 能抑制超糖基化的突变类型
mnn alg och
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素介导的蛋白质降解作用
靶蛋白
Lys
HOOC
Ubiquitin 76 aa
ubiquitin ligase E3 靶蛋白
Lys
转化质粒在酵母细胞中的命运
单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10-30倍 均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的 单双链 均可转化酵母菌 倍 含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制 含有复制子的单链质粒进入细胞后， 不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体 不含复制子的单链质粒进入细胞后， 这对于体内定点突变酵母基因组极为有利 克隆在YIp整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体 整合型质粒上的外源基因， 克隆在 整合型质粒上的外源基因 DNA的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总 的同源序列，会发生高频同源整合， 的同源序列 数的50-80% 数的
7 酵母基因工程
D 酵母菌的转化系统
酵母菌的转化程序 转化质粒在酵母细胞中的命运 用于转化子筛选的标记基因
酵母菌的转化程序
酵母菌原生质体转化法
早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化 法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的 的存在下， 的存在下 转化细胞可达原生质体总数的1-2%。 。 但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约 但该程序操作周期长， 原生质体转化法的一个显著特点是， 原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳 多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的 多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25-33%
酵母菌的转化程序
酵母菌电击转化法
酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA， ， 酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒 但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较很大的负 ， 但在此过程中应避免使用 作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件 作用。 适用范围广，而且转化率可高达 适用范围广，而且转化率可高达105 / µg DNA。 。
含有TEL的YAC质粒的构建 的 含有 质粒的构建
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有酵母菌染色体DNA同源序列的 同源序列的YIp质粒的构建 含有酵母菌染色体 同源序列的 质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基因， 特定序列和标记基因， 在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体 特定序列和标记基因 构建出来的质粒称为Yip。目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定 。目的基因表达盒通常插在染色体 构建出来的质粒称为 特定 序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区域 序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体 区域
7 酵母基因工程
B 酵母菌的宿主系统
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括： 目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括： 酵母属 如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 如酿酒酵母（ ）
1 基因工程概论 2 基因工程的基本原理 3 基因工程所需的基本条件 4 基因工程的操作过程 5 目的基因的克隆与基因文库的构建 6 大肠杆菌基因工程 7 酵母基因工程 8 哺乳动物基因工程 9 高等植物基因工程 10 外源基因表达产物的分离纯化
7 酵母基因工程
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 B 酵母菌的宿主系统 C 酵母菌的载体系统 D 酵母菌的转化系统 E 酵母菌的表达系统 F 利用重组酵母生产乙肝疫苗
7 酵母基因工程
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 酵母菌表达外源基因的优势
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚， 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国 认定为安全 基因工程受体系统（ 的 基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS 酵母菌是最简单的真核模式生物 ）
RAF STB REP1 IR FLP
A ori IR 同源重组
REP2
酵母菌中的野生型质粒
乳酸克鲁维酵母中的线状质粒
乳酸克鲁维酵母中含有两种不同 的双链线状质粒pGKL1和pGKL2 和 的双链线状质粒 拷贝数为50-100个，分别携带K1 拷贝数为 个 分别携带
反向重复序列 pGKL1 8.9 kb DNA聚合酶 毒素蛋白αβ 免疫蛋白 γ 亚基 聚合酶 毒素蛋白αβ
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有CEN的YCp质粒的构建 的 含有 质粒的构建
CEN为酵母菌染色体 为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列 为酵母菌染色体 上与染色体均匀分配有关的序列 将CEN DNA插入含 插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为 的质粒中， 插入含 的质粒中 获得的新载体称为YCp YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1 - 5个 质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有 质粒具有较高的有丝分裂稳定性 个
ubiquitin ligase E3 靶蛋白
Lys
蛋白酶体
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因
酵母菌共有四个泛素编码基因： 酵母菌共有四个泛素编码基因：
UBI 1 编码泛素-羧基延伸蛋白 （CEP52） 对数生长期表达 稳定期关闭 编码泛素 羧基延伸蛋白52（ 羧基延伸蛋白 ） UBI 2 编码泛素-羧基延伸蛋白 （CEP52） 对数生长期表达 稳定期关闭 编码泛素 羧基延伸蛋白52（ 羧基延伸蛋白 ） UBI 3 编码泛素-羧基延伸蛋白 （CEP76） 对数生长期表达 稳定期关闭 编码泛素 羧基延伸蛋白76（ 羧基延伸蛋白 ） UBI 4 编码泛素五聚体 对数生长期关闭 稳定期表达
7 酵母基因工程
C 酵母菌的载体系统
酵母菌中的野生型质粒 酵母菌克隆表达质粒的构建
酵母菌中的野生型质粒
酿酒酵母中的2µ环状质粒
几乎所有的酿酒酵母中都含有2µ 几乎所有的酿酒酵母中都含有 µ双链 环状质粒，拷贝数达50至100个。 环状质粒，拷贝数达 至 个 IRs 反向重复序列，600 bp，重组 反向重复序列， ， FLP 编码产物驱动IRs的同源重组 的同源重组 编码产物驱动 REP 编码产物控制质粒的稳定性 STB REP的结合位点 的结合位点 接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及 和 接合酵母属中的 ， 克鲁维酵母属中的pKD1等均与 µ质 等均与2µ 克鲁维酵母属中的 等均与 粒类似。 粒类似。 B
其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽， 其中酿酒酵母பைடு நூலகம்遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵 表达外源基因最理想。 表 表达外源基因最理想。 母达外源基因最理想
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型
突变类型 生物效应 改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 提高重组蛋白表达 改善重组蛋白分泌 提高重组蛋白表达 作用位点 钙离子依赖型的ATP酶 酶 钙离子依赖型的 转录后加工 转录水平 转录水平 羧肽酶Y 羧肽酶 转录水平
酵母菌共有七个泛素连接酶基因： 酵母菌共有七个泛素连接酶基因：
UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7 、 、 、 、 、 、
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素降解途径衰减的酿酒酵母
UBI 4缺陷型： 缺陷型： 缺陷型 在酿酒酵母菌中，泛素主要由 基因表达， 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能 基因表达 正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多， 正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多， 因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体 因此 缺陷突变株是外源基因表达理想的受体 UBA 1缺陷型： 缺陷型： 缺陷型 UBA1编码泛素激活酶 ，UBA1突变株是致死性的，但其等位 编码泛素激活酶E1， 突变株是致死性的， 编码泛素激活酶 突变株是致死性的 基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解 基因缺陷是非致死性的， Ubc4 - ubc5 双突变型： 双突变型： 七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效
ssc1 ssc2 rgr1 ose1 ssc11 rho-
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团， 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团， 影响蛋白质的生物活性。 它们常常影响蛋白质的生物活性 它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖 链两部分组成。 链两部分组成。 酵母菌普遍拥有蛋白 质的糖基化系统，但野生 质的糖基化系统， 型酿酒酵母对异源蛋白的 糖基化反应很难控制，呈 糖基化反应很难控制， 超糖基化倾向，因此超糖 超糖基化倾向， 基化缺陷株非常重要。 基化缺陷株非常重要。
克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 如乳酸克鲁维酵母（ ） 毕赤酵母属 裂殖酵母属 汉逊酵母属 如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 如巴斯德毕赤酵母（ ） 如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） 如非洲酒裂殖酵母（ ） 如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha） 如多态汉逊酵母（ ）
酵母菌的转化程序
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、 ）、PEG、热休克 酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（ 、 处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有下列特性： 处理后，也可高效吸收质粒 ，而且具有下列特性： 吸收线型DNA的能力明显大于环状 的能力明显大于环状DNA，两者相差 倍 吸收线型 的能力明显大于环状 ，两者相差80倍 共转化现象极为罕见
7 酵母基因工程
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 酵母菌的分类学特征
酵母菌（ 芽殖或 方式进行无性繁殖 酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细 ）是一群以芽殖 裂殖方式进行无性繁殖的单细 胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵 真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（ 子囊菌纲 ）、担子菌纲 母）、半知菌类（半知酵母菌），共由 个属和 半知菌类（ ），共由 个属和500多个种组成。如 多个种组成。 菌）、半知菌类 半知酵母菌），共由56个属和 多个种组成 果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统， 果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是 最 成熟的真核生物表达系统。 成熟的真核生物表达系统。
K2两种能使多种酵母菌致死的毒 两种能使多种酵母菌致死的毒 素蛋白编码基因（α β γ），同时含有毒素蛋白抗性基因。 γ），同时含有毒素蛋白抗性基因。 ），同时含有毒素蛋白抗性基因 素蛋白编码基因（
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有ARS的YRp质粒的构建 的 含有 质粒的构建
ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每 为酵母菌中的自主复制序列， 为酵母菌中的自主复制序列 ，染色体上每30-40kb 就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标 元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、 就有一个 元件 记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。 记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒 。 为复制子的质粒称为YRp 以ARS为复制子的质粒称为 为复制子的质粒称为 以2µ质粒上的复制元件为复制子的质粒称为 µ质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养几代 个 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达 后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。 质粒的丢失率高达 ，主要是由于分配不均匀所致。
突变类型 生物效应 甘露糖生物合成缺陷型 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型 外侧糖链添加缺陷型 能抑制超糖基化的突变类型
mnn alg och
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素介导的蛋白质降解作用
靶蛋白
Lys
HOOC
Ubiquitin 76 aa
ubiquitin ligase E3 靶蛋白
Lys
转化质粒在酵母细胞中的命运
单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10-30倍 均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的 单双链 均可转化酵母菌 倍 含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制 含有复制子的单链质粒进入细胞后， 不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体 不含复制子的单链质粒进入细胞后， 这对于体内定点突变酵母基因组极为有利 克隆在YIp整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体 整合型质粒上的外源基因， 克隆在 整合型质粒上的外源基因 DNA的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总 的同源序列，会发生高频同源整合， 的同源序列 数的50-80% 数的
7 酵母基因工程
D 酵母菌的转化系统
酵母菌的转化程序 转化质粒在酵母细胞中的命运 用于转化子筛选的标记基因
酵母菌的转化程序
酵母菌原生质体转化法
早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化 法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的 的存在下， 的存在下 转化细胞可达原生质体总数的1-2%。 。 但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约 但该程序操作周期长， 原生质体转化法的一个显著特点是， 原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳 多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的 多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25-33%
酵母菌的转化程序
酵母菌电击转化法
酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA， ， 酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒 但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较很大的负 ， 但在此过程中应避免使用 作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件 作用。 适用范围广，而且转化率可高达 适用范围广，而且转化率可高达105 / µg DNA。 。
含有TEL的YAC质粒的构建 的 含有 质粒的构建
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有酵母菌染色体DNA同源序列的 同源序列的YIp质粒的构建 含有酵母菌染色体 同源序列的 质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基因， 特定序列和标记基因， 在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体 特定序列和标记基因 构建出来的质粒称为Yip。目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定 。目的基因表达盒通常插在染色体 构建出来的质粒称为 特定 序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区域 序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体 区域
7 酵母基因工程
B 酵母菌的宿主系统
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括： 目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括： 酵母属 如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 如酿酒酵母（ ）