硝酸还原酶测定方法

硝酸还原酶活力的测定

1原理

硝酸还原酶（ nitrate reductase,NR ），是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐（NO3ˉ+NADH+H ＋→ NO2ˉ+NAD＋+H 2 O ）。产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α- 萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。其反应如下：

生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般单位鲜重以ug/(g·h) 为单位。NR 的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。

药品配制

1)0.1mol/L pH为7.5的磷酸缓冲液: 称取Na2HPO4·12H2O 30.0905g, NaH2 PO4·2H2O

2.4965g, 溶解并定容至1000ml.

2)0.2 mol/L KNO3溶液: 2.5275g KNO3用pH为7.5的磷酸缓冲液溶解并定容至100 ml.

3)30%三氯乙酸：75.0g 三氯乙酸用水定容至250mL。

4)硝酸试剂的配制: 0.5g α-萘胺加水煮沸1-2分钟,趁热加入1.25g 对氨基苯磺酸,再

加250 ml冰醋酸,加水定容至500mL.保存于暗处.

2酶活性测定

1)称样: 从田间取回新鲜叶片，用水洗净，吸干水份，用打孔器打出直径 0.5cm 的叶圆

片，用蒸馏水冲洗叶圆片 1 ～ 2 次，用吸水纸把水吸干后，称取等重叶圆片4份，每份重 0.5 g ，放入50mL的三角瓶中。

2)抽提: 正常处理—→向每个三角瓶中先后加入5mL磷酸缓冲液溶和5mL硝酸溶液；

对照处理—→先加1mL三氯乙酸,再加其它两种溶液。

在黑暗的条件下用真空泵反复抽提30分钟.

3)放置: 在黑暗,25℃条件下放置30分钟.

4)终止反应: 正常处理—→向三角瓶中加入1mL三氯乙酸；

对照处理—→不加三氯乙酸。

然后吸取反应液 2mL，然后各加8 mL硝酸试剂.30分钟后用分光光度计在 540 nm 波长下比色.

3计算公式

NR活性ug/(g·h) ＝B*11*10/（2*m*h）

B:比色液中浓度ug/g·h

M:样品质量 g

H:时间（小时）

硝酸还原酶活力的测定