噬菌体效价的测定

噬菌体效价的测定
一.目的要求
1.学习噬菌体效价测定的基本方法。
2.掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价的基本方法。
二、基本原理:
噬菌体的效价就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌斑，因此，能进行噬菌体的计数。但因噬菌斑计数方法其实际效率难以接近100%(一般偏低，因为有少数活噬菌体可能未引起感染)，所以为了准确地表达病毒悬液的浓度(效价或滴度)一般不用病毒粒子的绝对数量而是用噬菌斑形成单位(Plaque-forming units,简写成pfu)表示。
三、器材及试剂:
1.大肠杆菌18小时培养液（生物大分子研究室惠赠），
2.大肠杆菌噬菌体10-2稀释液（原液滴度107～1012pfu/ml）（生物大分子研究室惠赠） ；
3.含0.9ml液体培养基的Eppendof管4个
4.肉膏蛋白胨琼脂平板5块（10ml培养基，2%琼脂，作底层平板用）
5.含20ml灭菌琼脂糖培养基锥形瓶一个（0.7%琼脂糖，作顶层培养基用）
6.灭菌小试管5支，灭菌1ml吸管若干，48℃水浴箱等
四、操作步骤：
1．稀释噬菌体
(1) 将4管含0.9ml液体培养基的Eppendof管分别标写10-3，10-4，10-5和10-6。
(2) 用1ml无菌吸管吸0.1ml 10-2大肠杆菌噬菌体，注入10-3的试管中，旋摇混匀。
(3) 用另一支无菌吸管从10-3管中吸0.1ml加入10-4管中，混匀，余类推，稀释至10-6管。
2．噬菌体与菌液混合
(1)将5支灭菌空试管分别标写10-4，10-5，10-6，10-7和对照。
(2)用吸管从10-3噬菌体稀释管吸0.1ml加入10-4的空试管内，用另一支吸管从10-4稀释管内吸0.1ml加入10-5空试管内，直至10-7管。
(3)将大肠杆菌培养液摇匀，用吸管取菌液0.9ml加入对照试管内，再吸0.9ml加入10-7试管，如此从最后一管加起，直至10-4管，各管均加0.9ml大肠杆菌培养液。
(4)将以上试管旋摇混匀。
3．顶层培养基加入混合液内
(1)将顶层培养基熔化，冷却至～50℃，并放入50℃水浴箱内保温。
(2)分别向4管混合液和对照管对号加入3ml顶层培养基。每一管加入顶层培养基后，立即振摇混匀。
4．接种了的顶层培养基倒入底层平板上
(1)将旋摇均匀的顶层培养基迅速对号倒入底层平板上，放在台面上轻摆摇匀，使顶层培养基铺满平板（如不能铺满，培养基凝固后不要继续摇动）。
(2)凝固后，倒置37℃培养。记录培养时间
5．观察平板中的噬菌斑，将每一稀释度的噬菌斑数目记录于实验报告表格内，并选取 30～300个噬菌斑的平板计算每毫升未稀释的原液的噬菌体数（效价）。
噬菌体效价=噬菌斑数×稀释倍数×10
五、实验报告:
1．结果
(1)记录平板中每一稀释度的噬

菌斑数于下表中。并记录培养时间

(2)噬菌体效价是多少？
六.思考题：
（1）什么因素决定噬菌斑的大小？
（2）测定噬菌体效价，操作时要注意些什么才能测定准确？
（3）噬菌体与菌液混合后保温时间越长其吸附率越高的说法对吗？
（4）为什么选用双层琼脂平板法测定噬菌体效价？
七.实验关键问题，注意事项及实验要求
1.关键问题：稀释，温度，倒板
2.注意事项：移液器使用及登记，
3.实验要求
4.预习报告（写清具体实验步骤），试管清洗，Tip回收，实验室卫生，保持安静，结果观察请于实验后第二日观察。
5.实验报告要求（清晰简洁，记录关键内容）
6.实验过程，实验报告及实验考核综合评定此次实验成绩。
八.物品准备
1.ER2738菌液：每组～10ml（注意保持无噬菌体污染）
2.M13KE：每组一只（1ml）
3.稀释用培养基：无菌水替代（TBS）
4.实验操作无需在超净台进行（原因，另外是否所有测定滴度的实验都可以）
5.EP管，Tip头用量
6.培养皿（实验台面），固体培养基（培养箱），顶层培养基（培养箱内）（感谢）