SOD酶活力测定实验

摘要：通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶，经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩

等过程，除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白，采用葡聚糖（Sephadex G-100）凝胶层析得到纯化的SOD酶。跟踪提纯过程活性的分布，并评价提取过程各步骤的效率。实验结果证实随着不断的分离提纯，总活力以及总蛋白不断减小，比活力不断上升，最终得到的结果为总纯化倍数为0.68，活性得率为5.24%。

一、前言：

超氧化物歧化酶简称SOD，是一种新型酶制剂，属金属酶。分布很广，几乎从哺乳动物到细菌，以及植物中均存在。在微生物中主存于需氧菌。SOD是催化超氧阴离子（O2-）歧化反应的酶类，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2.H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O 和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。它的存在与生物体内的解毒作用有关，也发现与机体的衰老、肿瘤及免疫性疾病等有关。

自1968 年发现SOD 后，立刻引起科学界的高度重视，近40 年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD 也有了产品.国外从牛红细胞中制得的超氧化物歧化酶，其商品名为Orgotein.不少人研究Orgotein的药理性质，证明它无毒，无抗原性，能抗发炎、抗超氧离子、抗病毒感染。二十世纪80 年代后期，我国关于SOD 的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。SOD作为治因而受到医药界的关注。目前中国国内已进入临床试验阶段。

本实验以绿豆为原料提取SOD，通过各步的分离提纯，应测得酶总活力逐渐减小，比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程，以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。

二、实验材料与方法：

<一>材料:绿豆种子,市售新鲜绿豆种子浸泡蒸馏水24小时备用.

<二>试剂:葡聚糖（sephadexG-100）, NaCl（AP）, 磷酸氢二钠（AP）, 磷酸二氢钠（AP）, 三羟甲基氨基甲烷（Tris）, 盐酸（浓盐酸），硫酸铵（AP）, PEG6000 ，考马斯亮蓝G250 , 磷酸，乙醇（95%），牛血清蛋白BSA , 连苯三酚(焦性没食子酸), EDTA(钠盐) , 超氧化物歧化酶（sigma公司）。

<三>仪器:离心机，紫外分光光度计，柱层析装置，玻璃层析柱，匀浆机，各型号烧杯、试管、量筒，带毛塞试管，漏斗，移液枪，移液管，玻璃棒，电子天平等。

<四>实验方法和步骤：

1．称25g绿豆,洗涤，蒸馏水浸泡过夜，加入250 ml pH7 0.05 mol/L pb液，匀浆机匀浆，两层纱布过滤，离心（3000 rpm）得清液，取少量清液作为样1进行SOD活性测量，计算材料中SOD总活性单位及比活性单位（units/mg Pr）。

2．所得清液测量总体积，缓慢加入硫酸铵至35％饱和度，浓度为19.4g/100ml，4℃冰箱静置分层。

3．离心（3000rpm）取清液，取少量为样②，测量SOD活性、蛋白质含量测量，计算SOD总活性单位及活性单位。

4． 步骤3中的清液缓慢加入硫酸铵至65%饱和度（过程充分搅拌），5℃至分层，离心

（3000rpm ） 取沉淀，取样③，计算SOD 总活性单位及活性单位。

5． 准备透析袋：透析袋事先预处理，Na 2CO 3 10g/L, EDTA 1 mmol/L 煮沸30分钟，蒸

馏水洗涤，并浸泡于5℃中备用。

6． 所得清液测量其部体积，缓慢加入硫酸铵至65%饱和度（18.4g/100ml ）（过程充分

搅拌），5℃ 静置至分层澄清，离心除去清液，得沉淀。沉淀溶于水并定容到一定体积，装入透析袋，于蒸溜水中透析过夜。透析后溶液用滤纸过滤得清液。重新装入透析袋中用PEG6000包埋进行浓缩。

7． 装柱：先向柱内加满洗脱剂，检查是否漏水；再打开出液口，排出里面的气泡，特别

是要排除床底支持物上的气泡。关闭出液口，使柱中洗脱剂的体积约占总柱体积的15％。 调节有利于装柱的凝胶浆稀稠度，适当稀释有利于装柱过程中气泡的排除。但稀释度太高则一次装柱的高度不够。将一根直径稍小的玻璃棒插入层析柱底部，沿玻璃棒将胶浆徐徐注人柱内，一边灌胶，一边提起玻棒。注意避免产生气泡。柱要一次装完。柱装好后，停10min ，然后打开出液口，排出过量洗脱剂。柱内胶面上部保留2～3cm 洗脱剂。再将恒压洗脱剂瓶与柱上端相连。流过至少2倍住体积的洗脱剂之后，流速开始稳定下来（层析柱平衡过程,1ml/min,1.5h ）。调节恒压洗脱剂瓶的高低位置，得到理想流速。（1ml/min ）

8． 加样：上述浓缩液过滤后得清液加样，要尽量快速、均匀。一般分级分离时加样体积

约为凝胶柱床体积的1％～5％(质量分数)左右.（这里用5%）。加样应加于柱中心，避免沿柱壁加入。

9． 洗脱：恒压重力洗脱。这里采用1ml/min,一般每一收集部份不大于2ml ，本实验因为

仪器的数量问题，每份收集4ml,收集液总体积为柱床总体积的1.2倍即完成收集。 10． 层析过程： ①样品：浓缩液→ 离心→过滤→⎩⎨

⎧4

ml 20取样体积

②上样：5％上样量2－3mol ③洗脱:1mL/min,3mL/支，共收15管 测（1）A280值 ，（2）SOD 活性（粗略）15支管 ，每支3mL （3）搜集活性峰并测酶活性

连苯三酚法测定SOD 活性：

操作：25℃，3 ml 50 mmol/L pH8.30 的Tric-HCL 缓冲液，加入10l μ 50 mmol/L 连苯三酚（具体加入量应每次测量前校正，加入的原则是使下面的A325变化控制在0.07／min 左右），迅速摇匀，倒入光径1 cm 的比色杯(应该用石英杯)中，每30s 测一次Ａ325值，自氧化速率的变化（A ）控制在0.07／min 左右，加入酶液后再测连苯三酚自氧化速率的变化（A ’），酶量的加入控制在使加样后的A ’在0.035/min 左右。（以上A 和A ’的变化值不需特别严格，A 只要控制在0.1以下0.04以上，A ’变化在A 的约一半左右即可）。

考马斯蓝G-250测蛋白的方法： 操作方法：

1） 牛血清蛋白标准曲线的制作: 按下表加入试剂,混匀静置2分钟,以1号管为空白调零点,

测下各管的A595值,以吸光值(A595)为纵坐标,每管蛋白质含量为横坐标作出标准曲线。