定量RT-PCR原理

达到阈值时的计算公式
RB, Rs 和 Ex 是确定的 Rn=RT=阈值 n=CT= 达到阈值时的循环数
RT RB X O (1 E X )CT RS
CT值与起始DNA拷贝数的关系
Ct 起始DNA拷贝数
Rn (荧光信号)
阈值的作用：确定CT值
Threshold（阈值）
Cycle Number（循环数）CT
每个样品重复6次以上 消除定量误差
amplifications (FAM™) in replicates of 5
18S ribosomal RNA endogenous control amplifications (VIC™) showing all 20 sample wells
Detection of mRNA splice variants
确定足够的样品数，保证可对PCR扩 增产物量间差异进行统计分析。
非竞争性RT-PCR
目前主要采用荧光实时RT-PCR，放 射性标记核苷酸的方法已基本淘汰。
实时RT-PCR
实时RT-PCR就是在PCR扩增的每一个循 环后分别检测其PCR产量，借助计算机数据 处理，可以描绘出PCR扩增循环过程中PCR产 物变化曲线。
要求：拷贝数，%，ng/uL, mol/uL 如转基因定量的国际标准是%(w/w) ，标准品
最好是先将不同重量比的转基因与非转基因 食品粉末混合，然后抽提DNA；不要先抽好 DNA，再用水梯度稀释 如果要得出的是样品中的基因拷贝数，则梯度 稀释已知摩尔浓度的DNA
内对照用于确认阴性结果
目的基因 CtFAM = 40
Multiplex RT-PCR
Advantage: Time and reagent saving Limitation: availability of multiple reporters
excitation and detection ability
多重定量PCR结果
TNF-, TGF-, TNF- and lymphotoxin-
Hybridisation Probe Method
Taqman荧光定量PCR技术
•特异性荧光 标记探针
•Taq酶 5’→3’ 外切酶活性
设置内参照
分为两种：在扩增反应中加入的外 源参照物和样品中正常存在的内源参照 物。
内源性参照物通常使用“管家” 序 列或rRNA。
实时RT-PCR特点
扩增反应处于对数增长期，无平台效应。 无需处理PCR反应产物，减少污染。 检测范围更宽，速度更快。
IPC (VIC layer) 基因 CtVIC = 27
假阴性结果
目的基因 CtFAM = 40
IPC (VIC layer) 基因 CtVIC = 40
阳性结果
目的基因 CtFAM = 29
IPC (VIC layer) 基因 CtVIC = 28
重复样品
定量的结果需要进行统计学处理：平均值和 标准偏差。因此需要重复实验
- 非同源性片段——除两端引物－模板 区以外与靶序列不同
竞争性RT-PCR面临的问题
变异主要来源是样品RNA的纯度和完整性，应 设内源性参照物。
若使用DNA参照物，反转录酶的效率未受控 制。
RT-PCR定量的条件
确定PCR反应曲线上的有效范围，即 在平台效应出现以前PCR扩增得到的终 产物与加入的RNA数量呈线性关系。
校正管间差异，保证实验结果的重现性
5’ Nuclease Multiplex Assay
FAM™ dye labeled 35S Target VIC™ dye labeled ER
阳性内对照(IPC)
为操作方便，取样一般以克或uL为单位 IPC一般选用基因组中单拷贝的管家基因，其
定量结果代表了基因组的数量，也就是检材 中细胞的数量。 CT = CT Sample - CT IPC将定量结果校正为以基 因组为单位，不同样品之间具可比性。
内参比（Internal Standard）－ROX 校正样品管和加样误差
内对照（Internal Control）： 校正扩增效率的误差
+/-对照：检验试剂和仪器的可靠性 6次重复：满足统计学要求
多色荧光技术
准确的荧光定量要求ROX校正和IPC校正 检材和对照最好在同一反应管中，误差最小 多重检测要求仪器有多种荧光检测能力 只有ABI的仪器才具有四色检测能力：
确定阈值的标准：基线
阈值 = 基线（背景）信号均值 ＋基线（背景）信号标准偏差 x
10
基线
标 准 偏
阈 值
基线的范围： 从第3个循环起到指数增长开始
差
前3个循环止。
一般取3-15循环。
3个循环
阈值选择的推导原理
1. 基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引 起的
2. 偶然误差的结果满足对数分布 3. 阈值 = 基线（背景）信号均值＋基线（背景）信
Application
Quantification Mutation/Allele detection Multiplex RT-PCR Detection of mRNA splice variants
Mutation/Allele detection
Use different reporter dyes One increase homozygosity Two increase heterozygosity
主要内容
1. Taqman探针原理 2. CT值和阈值的确定 3. ROX内参比荧光的作用 4. IPC内对照的作用
退火，开始延伸
Forward 5’Primer
3’
5’
TaqMan®
R Probe Q
5’
3’ 5’
Reverse Primer
替换
Forward
R
5’Primer
3’
5’
Q
Байду номын сангаас5’
号标准偏差 x 10 4. 由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阈
值的概率小于10－5 5. 当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR的扩
增使得荧光信号强度可以测量得到
PCR 反应曲线
Threshold Baseline
Rn+
Sample
Rn
Ct
RnNo Template
定量准确的要素
未知样品 标准品：产生标准曲线
阳性内对照(IPC)
IPC除了用于计算CT，校正定量结果外，还可以起 到阳性对照的作用，用于判断阴性结果的真伪。
真阴性 检材-； IPC+ 假阴性 检材-； IPC-
常用的内对照：
18S rRNA -actin GAPDH
标准品的选择
标准品可以从ABI购买，也可以自己制备 标准品的单位并不重要，取决于对最终结果的
根据PCR 变化曲线计算出目标靶基因 分子数。
传统RT-PCR与实时RT-PCR的流程比较
荧光定量RT-PCR基本流程
荧光测定的光学原理图
反射镜
光源 滤光镜
夫累舍尔透镜 96孔透镜组
双色镜
多元镜
96孔板
滤镜轮
CCD 相机
Molecular Beacon Method
Dye Incorporation Method
William P. Halford:
是否只有竞争性RT-PCR才能精确定量？
竞争性RT-PCR
PCR的终产物量取决于靶序列与竞争性 序列量的起始比例。
理想情况下，靶序列与参照物以相同 的效率扩增，在琼脂糖凝胶电泳中区别开 。
竞争性RT-PCR
参照物片段分两类: - 同源性片段——与靶序列只有微小差 别
使用参比荧光 校正的结果
样品管1 样品管2
ROX荧光内参比的作用
以固定浓度存在于TaqMan PCR缓冲液中，常用ROX 荧光强度均一化(Normalize)：
Rn = RReporter / RROX， Rn = Rn,sample – Rn,blank 影响荧光信号强度的因素包括：
光纤出口处的激光强度；管盖厚度、透光性 缓冲液和反应体积等
FAM：标记目的基因探针 VIC：标记第二个目的基因或IPC探针 TAMRA：淬灭基团 ROX： 内参比荧光
使用ROX内参比的效果
使用 ROX
不使用 ROX
Beta actin TaqMan定量
使用ROX内参比的好处
提高荧光定量的定量精度，减少孔间差异
不使用参比荧光 校正的结果
报告荧光 参比荧光
3’ 5’
Reverse Primer
剪切
R
5’ 3’ 5’
Q
5’ 3’ 5’
延伸结束
R
5’ 3’ 5’
Q
5’ 3’ 5’
荧光定量PCR实验荧光强度的计算公式
Rn RB X O (1 EX )n RS
Rn=总荧光强度 RB=基本（空白）荧光强度 XO=靶基因起始拷贝数 EX=扩增效率（0< EX < 1） n =扩增循环数 RS=每个荧光分子的荧光强度