Wntβ-catenin信号通路在骨关节炎软骨修复中的调控研究

Wnt/β-catenin信号通路在骨关节炎软骨修复中的调控研究 【摘要】Wnt 信号通路广泛地存在于生物体中，调节控制着如细胞形态与功能的分化及维持、免疫、应激、凋亡等生命过程。

随着对其研究的不断深入，发现Wnt 信号通路对早期软骨的化生与形成、体外软骨细胞的增殖与分化具有重要的作用，特别是其经典Wnt/β-catenin信号通路与骨关节炎的发生发展有重要联系，Wnt 蛋白家族、β-catenin以及相关抑制因子可以调节软骨细胞功能和代谢。

【关键词】Wnt 信号通路；β-catenin；软骨细胞； 骨关节炎【ABSTRACT】 The Wnt signaling exists in every kinds of species and r egulates a variety of biological processes including cell fate，proli feration and function，immunity，stress，apoptosis and so on． During the researching，Wntsignaling also plays an important role in chondr ocyte differentiation and maturation．Wnt protein family, β-catenin and related inhibitors can regulate the function and metabolism of ch ondrocytes.
【Key words】Wnt signaling pathways； β catenin Chondrocytes； Osteo arthritis；； Review literature
骨关节炎( Osteoarthritis, OA )又称为退行性关节炎, 是以关节软骨退变及破坏为主要病变特征的慢性疾病。

流行病学调查65岁以上男性发病率为 60%，女性达30%。

临床表现为关节疼痛、肿胀和进行性功能丧失。

其病理变化主要表现为: 关节软骨的进行性破坏并影响关节滑膜、关节囊、关节韧带及周围肌腱、软骨下骨等。

影像学上主要表现为软骨组织破坏缺损，关节腔变窄，滑膜增生，软骨下骨硬化及骨赘形成。

研究表明OA 是由年龄、机械应激以及炎性介质等因素共同作用所导致的一种进行性病变[1]。

但其发病机理仍尚未完全阐明, 导致临床上针对OA的治疗效果常不尽意。

一、 骨关节炎
关节软骨的破坏是骨关节病病理发展过程中的一个重要部分。

传统认为关节软骨组织是软骨细胞和基质缓慢交替的永久组织。

基质为凝胶状、低通透性的蛋白多糖。

在正常生理条件下，关节软骨细胞在稳定的环境中能维持细胞外基质的稳定，而不是像生长区细胞那样处于过度增生状态。

有研究发现, 由滑膜细胞分泌的促炎细胞因子（如前列腺素、TNF α、IL1、IL 6、NO 等）在OA 的病理过程中的作用并不是关键的，反而有动物研究发现[2-3]，有基质金属蛋白酶（MMPs）、aggrecanases 等蛋白酶对关节软骨主要基质成分Ⅱ型胶原以及蛋白多糖的降解， 是导致OA 产生的主要原因。

OA的病理生理改变是炎症介质, 基质成分与特定受体结合传递信号进入细胞核, 激活基质金属蛋白酶和炎性基因的转录,从而使关节细胞激活[4]。

在关节软骨细胞从正常的状态下转化为像生长区细胞过度增长的肥大状态时，生长的标记性基因如Col-X、MMP-13［5］，以及其他的MMPs和Aggrecanses( ADAMTS-4、ADAMTS-5) 等会高度表达，而这些蛋白酶类能促使基质降解和关节软骨退化［6］。

机械压力和生化因子被则认为是在病变过程中的另一个重要部分。

异常压力负荷、炎症等因素打破软骨细胞外基质的分解与合成的代谢平衡。

Wnt 复合受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)缺失或获得的变异分别导致骨质疏松、假性神经胶质瘤综合征(osteoporosispseudogliomalsyndrome，O PPG)或高骨量，引起了众多科学家和临床医生对于Wnt 信号通路在骨生物和骨疾病中的作用的重视。

而Wnt 信号通路也是软骨细胞中MMPs、aggrecanases 等蛋白酶的上游信号通路，因此，近年来,针对Wnt 信号通路在OA 发生发展过程中的作用机制有了更深入的研究。

二、 Wnt信号通路
Wnt 是一类分泌性糖蛋白，大小约39-46 kD，是富含L-半胱氨酸的大家族，在人类基因组里已经发现和证实有19 个Wnt蛋白。

Wnt信号通路通过旁分泌或者自分泌的方式影响细胞的分化和增长。

现代研究认为Wnt 信号通路有四条途径: Wnt /β-catenin（β连环蛋白）信号通路、平板细胞极性信号通路、Wn
t/Ca2＋信号通路、含环磷酸腺苷（cAMP）效应元件结合蛋白的蛋白激酶A（PK A）信号通路。

其中Wnt/β-catenin 途径为经典途径，它是通过β-catenin 在胞质内的积累和稳定，调控目的基因表达,而 β-catenin 作为一种黏附分子在1980年被德国细胞生物学家Walt Birchmeier 首先发现。

正常功能状态下，大部分胞质内的β-catenin被束缚在由细胞膜向胞内伸出的E-钙黏着蛋白上，而其余部分与大肠腺瘤样蛋白和轴素多聚蛋白复合物结合，有利于胞浆中GSK-3β(糖原合成酶激酶)磷酸化与上述复合物结合的β-catenin，被磷酸化后的β-ca tenin易被泛素-蛋白酶体系统降解，从而保持胞质内游离β-catenin浓度处于相对较低的状态。

当Wnt信号通路活化时，Wnt与细胞表面特异性受体Frizzld e，低密度脂蛋白受体相关蛋白5或6(low densitylipoprotein5/6，LDL5/6)结合形成功能性连接受体复合体，使胞浆内的Dishevelled(Dvl)高度磷酸化从而被激活，活化后的Dvl蛋白抑制了GSK-3β活性，继而拮抗GSK-3β对β-catenin 的磷酸化、降解作用，使胞质内β-catenin 含量积聚并移至核内， 与核内转录因子TCF/LEF家族相连接，从而控制下游靶基因的转录和表达[7]。

Wnt 分子拮抗剂分为两大类: 一类是通过与Wnt受体竞争性结合Wnt配体的一些调控因子, 如分泌型卷曲相关蛋白( secreted frizzled-related proteins, SFRPs),因其具有半胱氨酸富含区( Cysteine rich dom ain,CRD)可与Wnt配体结合, 从而成为Frizzled蛋白的竞争抑制剂。

另一类是LRP5/6的抑制性配体, 通过与Wnt受体复合物的亚基LRP5/6 结合, 从而阻止Wnt- Frizzled和LRP5/6间的相互作用, 起到阻断Wnt信号通路的作用。

Dkk1( Dickkopf 1, Dkk1)作为分泌蛋白家族成员之一, 可通过与Lrp5/6形成三聚体诱导细胞快速内吞, 从而阻断信号通路。

有研究表明β-连环蛋白、Lrp5及Lrp6的缺失性功能突变对经典的Wnt信号通路起负调控作用[8-10] 。

Dkk1、SFRP1、SFRP2及Frzb 丧失性功能突变或Lrp5和Lrp6获得性功能突变则对该通路起正调控作用[11-13] 。

Wnt/β-catenin信号通路正是由于这些调节因子的不断变化，才会对软骨细胞、软骨下骨细胞的功能产生调节，甚至改变软骨及软骨下骨的生理状态，例如发生骨关节炎、风湿性关节炎
等相关疾病。

三、 Wnt/β-catenin通路与软骨细胞
有数据表明Wnt信号通路在骨发育、软骨及骨生物学中具有重要作用, 进而提示该信号通路可能与OA 的发生有关。

最近采用全基因组单核苷酸多态性( si ngle nucleo tide po lymorphism, SNP )筛查技术分析与OA 相关的遗传因素, 发现有些Wnt信号通路的分子伴侣是OA 的候选基因。

通过对Wnt 信号通路异常表达的调控技术证实，不同Wnt信号通路对不同分化时期的软骨细胞有着促进或抑制的不同作用［14］。

关节软骨对经典通路的反应是通过细胞外基质来实现的，在骨关节病中Wn t /β-catenin 通路影响关节软骨基质的形成和分解。

在间质细胞转化为软骨细胞的过程中，非经典通道的Wnt5a、Wnt5b 具有促进作用，而在成熟的软骨细胞中，细胞内的β-catenin 终止软骨细胞的分化，也就是阻止软骨内的骨化现象，这是骨关节的病理中软骨组织降解的重要机制。

而在软骨组织表面β-cate nin 的增加使软骨细胞发生增生肥大，细胞外基质分泌停止，MMP-13 增加，导致软骨组织发生结构性的破坏［15］。

研究发现在退变的软骨细胞内观察到β-cat enin增多,表明软骨的丢失与Wnt信号通路的激活有一定关系。

而用Wnt3a 分子刺激哺乳动物软骨细胞，可以使ADAMTS-4、ADAMTS-5等与骨关节病相关的蛋白酶产也增加。

另外, Yuasa[16]用Wnt-3a激活兔关节软骨细胞内的β-catenin信号, 结果促进了金属蛋白酶3和金属蛋白酶13的基因表达, 并且加强了IL- β的效应, 而IL - β是引起蛋白多糖基质丢失的主要因子之一, 同时又可诱导Dkk1 的表达。

而在在体外培养软骨细胞用IL-β 刺激，发现通过Wnt7a /β-catenin 途径可抑制二型胶原酶( CⅡ) 、软骨的形成并引起软骨细胞的去分化现象[17]。

Diarra 等[18] 的TNF转基因OA 小鼠模型实验研究中证实了通过抑制Dkk1, 可使关节软骨损伤得到部分逆转，Weng 等[19]用单克隆Dkk1抗体对Dkk1的作用进行中和, 结果显著消除了由IL- β介导的半胱天冬酶3对调控软骨细胞分裂和凋亡的作用。

Ma
k[20]等在对Ihh信号通路对软骨肥大的影响机制的研究过程中发现, Wnt/β-cate nin信号通路通过上调Ihh信号的表达从而达到对骨性关节炎过程中软骨肥大的调节作用。

但通过在Col2AI-ICAT-转基因鼠抑制β-catenin信号通路发现无论是在关节软骨细胞凋亡还是增加而关节软骨继续破坏。

因此正常水平的β-cate nin 对软骨细胞发挥正常的功能是很有必要的。

另外有研究发现软骨细胞中骨形态发生蛋白(BMp)信号位于β-catenin信号下游区, β-catenin信号部分通过激活BMP信号而刺激软骨细胞发育成熟BMp信号与β-catenin信号高度相关,且在出生后软骨细胞发育中发挥重要作用[21]。

四、 Wnt/β-catenin通路与骨关节炎
软骨细胞的增殖分化、成熟与凋亡，不仅参与了OA 病理变化的过程， 并且对于OA 的病理过程具有重要的作用。

而Wnt/βcatenin 信号通路调节着关节软骨的成熟、增殖分化以及凋亡， 并对软骨外基质分解代谢亦有着重要的作用［22］。

在转基因小鼠身上，特异性地调高了Wnt/β-catenin 信号通路后，会导致BMP 2、MMP 9、MMP13、aggrecanases的上调，引起骨赘生成以及软骨破坏等类似于OA的症状［23］；而特异性的抑制Wnt/β catenin 信号通路后也会使小鼠产生类似于OA 的症状。

并且在OA 关节软骨中，Wnt 7a 的表达量是上调的［24］。

与之相一致的是，在OA 关节软骨中也有大量的β-catenin 聚集［25-27］。

在机械性因素损伤的软骨中，Wnt16、Wnt 靶基因以及核内β- catenin 的表达量都是上调的。

虽然，在未受损伤的软骨中没有检测到的表达水平升高， 但在同一关节内的中到重度OA损伤软骨中，Wnt 16 和β-catenin皆显著升高［28］。

在退变的软骨细胞内亦可观察到β-catenin 增多。

而β-catenin 的过度表达以及β-catenin 的降解减少，都会引起β-catenin Tcf/Lef 转录水平升高，导致软骨细胞的细胞外基质合成停止［29］。

除此之外，Wnt3a和Wnt7a[30]，可通过刺激β-c atenin Tcf/ Lef 的转录活性来阻止软骨细胞中Ⅱ型胶原的表达。

β-catenin 的过度表达以及β-catenin Tcf / Lef 转录水平升高还会引起COX－2 表达量
的上调［31］。

Frzb编码的sFRP-3 是Wnt通路的拮抗剂, 近期有报道[32]Arg324Gly 置换后的sFRP-3与关节炎患者的发病有关, 此外Wnt拮抗剂Frzb的基因点突变也与OA 的高发性有关。

这些研究都证实了Wnt/β- catenin信号通路的增强可能
导致软骨的变性。

Peter等[33] 研究发现抑制sFRP- 1的表达能激活Wnt/β-caten
in信号通路从而使骨的形成和软骨的重塑增加, 从而导致骨性关节炎的发生。

近年来有学者开展了中药复方及提取物对Wnt信号通路干预的相关研究, 并取得了一些进展。

黄鹃 [34]等用半夏提取物( PTE )干预体外培养的人肝癌HepG2
细胞, 研究发现PTE 可抑制HepG2细胞的增殖及周期调控相关蛋白β- catenin
在细胞核内的定位及表达, 且抑制作用随剂量增加而增强。

黄涛等[35] 研究证实地黄管食通口服液可明显降低食管癌组织中β-catenin的表达, 具有抑制Wnt通路的作用。

吴滨等[36]研究证实中药方剂化积益肝煎可以使小鼠肝癌H22细胞中β-catenin表达降低, 进而抑制Wnt通路过度激活。

这些研究也为对Wnt通路的相
关间就提供了一个崭新的思路,可研究和开发中药制剂在治疗OA中的优势。

综上所述，骨关节病患病率高，可严重影响关节功能和降低患者的生活质量。

虽然对其病因及病理发展中的细胞因子、炎症因子、蛋白酶类有一定的认识，但是对它们之间复杂的作用过程尚没认识透彻。

Wnt 分子信号通路为研究
骨关节病发病机制开辟了新的途径; 对骨关节病的治疗和发展也将起到重要作用。

研究表明，Wnt/β-catenin 信号通路以及相关产物可以通过影响软骨细胞的成熟、分化与凋亡；减少软骨细胞中Ⅱ型胶原以及细胞外基质的合成；促进COX－2、MMPs、aggrecanases等蛋白酶的产生；诱使软骨下骨及骨赘的生成，
进而产生关节软骨进行性变性与破坏、关节软骨再修复、软骨下骨重塑与硬化
以及骨赘，并伴有滑膜和关节腔的一系列生化、形态学改变的OA 一系列病理变化，这表明Wnt/β- catenin 信号通路在维持关节和骨组织的生态平衡过程中
发挥至关重要的作用。

但目前的研究在多还相对局限， 在进一步研究Wnt/β-catenin信号通路的同时, 还应该就非经典Wnt通路对骨及关节的作用加以研究, 从而对Wnt通路中的各个组分在骨性关节炎的发生中所起的作用有更精确的认识,
为临床治愈骨性关节炎提供线索。

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