积雪草苷对小鼠脓毒症致急性肝损伤的保护作用研究

积雪草苷对小鼠脓毒症致急性肝损伤的
保护作用研究
（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）
作者：张丽娜，郑佳佳，李晓会，吴孟娇，张力，万敬员【摘要】目的研究积雪草苷对小鼠脓毒症致急性肝损伤的保护作用，并初步探讨其作用机制。

方法建立盲肠结扎穿孔(CLP)诱导的小鼠脓毒症致急性肝损伤模型，随后用不同剂量的积雪草苷(15，45 mg/kg)干预，24 h后检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、肿瘤坏死因子-alpha (tumor necrosis factor alpha，TNF-α)的含量; 免疫印迹法检测肝组织中环氧合酶-2 (cyclooxygenase-2，COX-2)的表达，并取部分肝组织进行组织病理学分析。

结果积雪草苷剂量依赖性地减少脓毒症诱导的血清中ALT、AST及TNF-α的升高，抑制肝组织中COX-2蛋白的表达，病理切片显示积雪草苷组肝组织受损程度较模型组为轻。

结论积雪草苷对CLP 诱导的肝损伤具有一定的保护作用，其机制可能与抑制炎症介质COX-2和TNF-α有关。

【关键词】积雪草苷; 脓毒症; 盲肠结扎穿孔; 急性肝损伤; 环氧合酶-2
Abstract：ObjectiveTo study the protective effect and mechanism of asiaticoside on sepsis-induced acute liver injury in mice.MethodsSepsis-induced acute liver injury was induced by cecal ligation and puncture (CLP) in Kun Ming mice. Subsequently，different doses of asiaticoside (15 mg/kg，45 mg/kg) were used to intervene. 24h later，serum alanine aminotransferase (ALT)，aspartate aminotransferase (AST) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α)levels were measured，western blotting was used to determine cyclooxygenase-2(COX-2) expression in liver tissues and histopathology examination was performed by hematoxylin-eosin(HE) staning method.ResultsThe results showed that asiaticoside decreased serum ALT，AST and TNF-αlevels，inhibited COX-2 expression in liver tissues，and histopathological changes of liver were improved by asiaticoside as compared to model group，and these effects were dose-dependent.ConclusionAsiaticoside has protective effect against sepsis-induced acute liver injury，and the mechanism is probably associated with the inhibition of TNF-αin serum and COX-2 expression in liver tissues.
Key words：Asiaticoside;Sepsis;Cecal ligation and
puncture;Acute liver injury;Cyclooxygenase-2
脓毒症及随后的多脏器功能障碍综合征(multi organ dysfunction syndrome MODS)已成为当今外科重症监护病房中的首要死亡原因之一。

据统计，全球每年有600 000例脓毒症患者死亡[1]，其死亡率高达50%。

在脓毒症发展过程中，肝脏是最易受损的器官之一。

脓毒症患者出现肝功能异常是其病情加重的标志。

因而，寻求脓毒症诱发的急性肝损伤的有效防治途径成为危重病医学亟待解决的问题。

积雪草苷(Asiaticoside)为积雪草提取物三萜皂苷的主要成分之一[2，3]，具有促进伤口愈合、抗溃疡、抗炎等作用[4]，临床上用于治疗慢性炎症、皮肤病等[5]。

本实验针对积雪草苷对炎症有效的特点，利用经典的小鼠盲肠结扎穿孔(Cecal ligation and puncture，CLP) 模型，研究积雪草苷对脓毒症诱发的急性肝损伤是否具有治疗作用并初步探讨其作用机制。

1 材料
1.1 药品与试剂积雪草苷(纯度95%，无色结晶，分子式：C48H78O19，相对分子量：959.15)，由广西昌洲天然植物开发有限公司提供，批号20060205;丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品;小鼠TNF-αELASA检测试剂盒(德国Bender公司);BCA蛋白定量试剂盒(pierce公司);诱导型环氧合酶2(COX-2)抗体(Abcam公司)。

1.2 动物及分组成年昆明小鼠，体质量18～22 g，40只健康小鼠，♂♀各半[重庆医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证
号SCXK(渝)20070001,使用许可证号SYXK(渝)20070001]。

随机分为4组：假手术组，模型组，积雪草苷小、大剂量干预组(15，45 mg/kg)，每组10只。

2 方法
2.1 CLP动物模型的制作[6，7] 行CLP手术之前1 h，假手术组与模型组给予等体积生理盐水，积雪草苷组腹腔注射对应剂量药物。

造模方法：动物在实验前1 d禁食，0.3%的戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，于小鼠腹正中线做一长约1 cm切口，找出盲肠并结扎其根部，保留血供，选用8号针头穿刺已结扎盲肠1次，挤出肠内容物少许，1-0丝线关闭腹腔。

生理盐水复苏(0.5 ml/10 g背部皮下注射)。

按照相同的方法处理假手术组的动物，但盲肠不穿孔不结扎，术后禁食不禁水。

2.2 小鼠生存率的观察CLP后24 h每6 h观察记录小鼠生存情况。

2.3 血清ALT和AST的检测24 h后存活小鼠眼球取血，离心
(3 000 r/min，10 min)取血清，按试剂盒说明书检测血清中ALT和AST的活性。

2.4 血清TNF-α的检测24 h后存活小鼠眼球取血，离心(3 000 r/min，10 min)取血清，按ELASA试剂盒操作，检测血清中TNF-α的水平。

2.5 肝组织COX-2蛋白表达的免疫印迹法检测24 h后处死小鼠，称取100 mg肝组织，研磨后裂解细胞提取蛋白，BCA法蛋白定
量。

取40 μg蛋白上样，SDS-PAGE电泳后，转移至硝酸纤维素膜上，室温下封闭1 h;加入一抗4℃冰箱封闭过夜;次日脱洗3次，二抗孵育1 h，再脱洗5次后，ECL显色，X线片曝光，洗片。

2.6 病理检查24 h后处死小鼠取肝脏左叶10%甲醛固定，脱水、脱钙后石蜡包埋切片，HE染色。

2.7 统计学处理各组数据以±s表示，运用SPSS软件对两样本均数t检验，P0.05表示有统计差异。

3 结果
3.1 小鼠死亡率观察结果见图1。

与假手术组比较，模型组中小鼠死亡率明显升高;而积雪草苷组可明显降低脓毒症致急性肝损伤引起的小鼠死亡率，且具有一定的剂量依赖性(P0.01)。

图1 积雪草苷对CLP致小鼠生存率的影响(n=10)
3.2 血清ALT、AST测定结果见图2。

模型组与假手术组比较，血清ALT、AST活性明显升高;而积雪草苷组可明显降低脓毒症致急性肝损伤引起的ALT、AST活性升高，且具有一定的剂量依赖性(P0.01)。

与模型组比较，**P0.01图2 积雪草苷对CLP致急性肝损伤小鼠血清ALT 和AST水平影响(n=6)
3.3 血清TNF-α含量测定结果见图3。

模型组血清TNF-α含量明显高于假手术组;而积雪草苷组可明显降低脓毒症致急性肝损伤引起的TNF-α含量升高，且具有一定的剂量依赖性(P0.01)。

3.4 积雪草苷对肝组织中COX-2蛋白表达的影响结果见图4。

模型组COX-2蛋白表达明显高于假手术组;而积雪草苷可显著降低急
性肝损伤中COX-2蛋白的过量表达，并呈现出一定的剂量依赖关系。

3.5 病理学检查结果结果见图5。

假手术组小鼠光镜下肝小叶结构完整，肝细胞索排列整齐，以中央静脉为中心呈放射状排列，肝细胞核位于肝细胞中央，圆而边界清。

模型组小鼠肝小叶失去正常结构，肝细胞索解离，肝细胞普遍变性坏死，肿胀，并可见大量炎性细胞浸润。

积雪草苷组肝细胞仍有部分变性坏死，且有少量中性粒细胞浸润，但病变程度远比模型组轻。

与模型组比较，**P0.01图3 积雪草苷对CLP致急性肝损伤小鼠血清TNF-α水平影响(n=6)a-假手术组b-模型组c-积雪草苷15 mg·kg-1d-积雪草苷45 mg·kg-1图4 积雪草苷对CLP致急性肝损伤小鼠肝COX-2表达影响a-假手术组b-模型组c-积雪草苷15 mg·kg-1 d-积雪草苷45 mg·kg-1图5 积雪草苷对CLP致急性肝损伤小鼠肝组织影响
4 讨论
盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)导致的脓毒症是一个经典模型，被广泛用于模拟临床脓毒症。

盲肠穿孔导致驻扎在肠道的微生物渗出，造成腹部局部感染、细菌性腹膜炎，随后引起全身性炎症反应(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，MODS 甚至死亡[8]。

脓毒症时，肝脏损伤发生较早，最终可发展为肝衰竭。

因此CLP模型是筛选和研究治疗或预防脓毒症时肝损伤药物的理想模型。

CLP诱导的脓毒症引起急性肝损伤，肝细胞细胞膜因脂质过氧化反应而功能受损、结构破坏，细胞内的ALT、AST释放入血，使血清中ALT与AST活性升高。

本实验显示积雪草苷各剂
量组明显抑制脓毒症引起的ALT、AST活性升高，减轻了肝损伤的程度，同时显著减轻了肝脏组织病理学变化，明显降低了CLP诱导的脓毒症致急性肝损伤引起的小鼠死亡率，并表现出一定的剂量依赖关系，对CLP诱导的脓毒症致急性肝损伤有一定的保护作用。

在脓毒症状态下，细菌及其毒素等产物刺激机体产生过量的细胞因子，导致机体正常调控机制失灵，形成炎症级联反应。

在这些细胞因子中，TNF-α发挥着重要的作用，研究显示阻断TNF-α的作用或减少TNF-α的释放都能降低CLP术后小鼠的死亡率[9]。

TNF-α具有潜在的细胞毒性并能引起炎症级联反应，其在肝损伤的病理机制中起着重要作用[10]。

在CLP诱导的脓毒症致急性肝损伤中，炎症反应被激活，TNF-α大量生成，导致肝细胞进一步坏死、凋亡，加重了肝损伤程度。

本实验表明积雪草苷显著降低了小鼠血清中的TNF-α水平。

环氧化酶-2(COX-2)是催化花生四烯酸生成前列腺素类物质的限速酶，在正常生理状态下，大多数组织中表达甚微，但细胞因子、生长因子、内毒素、炎症等可诱导其表达。

在脓毒症所致急性肝损伤中，过量表达的COX-2及其PGs产物可参与炎症进程，加重肝损伤程度。

研究显示COX-2抑制剂可减轻小鼠CLP术后脓毒症引起的急性肝损伤[11]。

本实验中积雪草苷能明显抑制肝组织中COX-2的表达，这也可能是其肝保护作用的主要机制之一。

综上所述，积雪草苷对CLP诱导的脓毒症致急性肝损伤小鼠有明显的保护作用，该作用可能与减少TNF-α的释放及COX-2的表达有关，其具体机制还需进一步探讨。

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