免疫标记技术详细版.ppt
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1、常用放射性核素
2、125I 的标记方法 直接法（氯胺T法） 间接法（连接法）
精选文档
33
标记免疫物的分离与鉴定
1、分离 目的：去除游离放射性核素 方法：柱层析
2、鉴定 游离放射性核素含量 免疫活性 比放射性（m精C选文i档/mg）应用意义 34
第六节 胶体金标记免疫技术 (金标法)
胶体金是由氯化金与还原剂反应形成 的一种胶体颗粒，具有吸附蛋白质的特性 (可以标记Ag或Ab)；
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13
戊二醛交联法（二步法）
COH-（CH2）3-COH + NH2-酶 抗体-NH2 + CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
精选文档
14
过碘酸盐氧化法
O O
NaIO4
酶-五炭糖环
O O
O
O
+ NH2抗体
O NaBH4 O
OH N
精选文档
用途 免疫组化 免疫分析测定 免疫分析测定
免疫组化 免疫分析测定 免疫分析测定 免疫组化 免疫分析测定 5
第二节 标记免疫技术的分类
一、按指示标记物质划分的类型
二、按测定方式划分的类型
三、按测定用途划分的类型
精选文档
6
按指示标记物质划分的类型
1、酶免疫技术 2、荧光免疫技术 3、放射免疫技术 4、金免疫技术
O
抗体
O O
N
抗体
H2O
O O
N
OH
OH
抗体
Schiff碱
精选文档
15
标记免疫物的分离与鉴定
源自文库
1、分离
目的：去除游离酶
方法：盐析、柱层析
2、鉴定
抗体活性
酶活性
标记物纯度精选文档
16
酶联免疫吸附实验
enzyme linked immunosorbent assay
（ ELISA ）
精选文档
17
ELISA基本的实验过程
125I OH
精选文档
30
间接法（连接法）
OH NSHPP
氯胺T
OH 125I
+ Na125I
CH2
O
H-C-C-O-N-C-CH2
H O O=C-C-CH2
CH2
O
H-C-C-O-N-C-CH2
H O O=C-C-CH2
精选文档
31
结合相
游离相
放射免疫分析精法选文档的原理与方法 32
常用标记方法
精选文档
11
常用标记方法
1、常用酶 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP）
2、标记方法 戊二醛交联法
过碘酸盐氧化法
精选文档
12
戊二醛交联法 (一步法）
抗体-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-抗体 酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
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7
按测定方式划分的类型
1、均相型（homogenous） 2、非均相型（heterogeneous）
精选文档
8
均相型（homogenous） 非均相型（heterogeneous）
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9
按测定用途划分的类型
1、免疫测定技术 2、免疫组化技术
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10
第三节 酶标记技术
一、常用标记方法 二、标记免疫物的分离与鉴定
胶体金颗粒具有呈色性，中等大小的 胶体金颗粒呈现酒红色。
胶体金标记免疫技术是将金颗粒光学
检测的灵敏性和抗原抗体反应的特异性相
结合。
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35
胶体金免疫法与RIA、ELISA等方 法相比,有许多优点：
1.它不需ELISA法中所要求的作用的底物和显色 剂，使操作更简便;
2.胶体金法无污染，不含危害操作者即污染环境;
抗原抗体反应 特异性
示踪物标记 灵敏性
酶 荧光素 同位素 其它
免疫标记技术的主要特点： 高特异性、高灵敏性
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4
常用的免疫标记物质
类别
标记物
荧光素
FITC、RB200、TRITC
镧系元素螯合物
放射性核素 3H、14C、32P、57Gr
125I、131I
酶
HRP、AP
化学发光物 Luminol、lucigenin 金属颗粒 胶体金、铁蛋白
27
标记免疫物的分离与鉴定
1、分离
目的：去除游离荧光素
方法：柱层析
2、鉴定
抗体活性
标记物结合度
F/P比值的应用意义
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28
第五节 放射性核素标记技术
一、常用标记方法 二、标记免疫物的分离与纯化
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29
直接法（氯胺T法）
-NHCHONH-
CH2
氯胺T
Na125I
4。C
OH
-NHCHONHCH2
3.胶体金标抗体在冻干状态下室温储存较稳定,有 效期长;
4.灵敏度高。
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36
免疫标记技术的比较
FIA
ELISA
RIA
敏感性
较低
高
高
特异性
高
高
高
重复性
差
好
好
检测对象 Ag/Ab
Ag/Ab
Ag
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37
生物标记荧光素的要求
1、具有与蛋白质共价结合的能力 2、荧光效率高 3、能与背景物质形成鲜明对比 4、不影响蛋白质的生物、免疫活性 5、标记方法安全、简便 6、标记物稳定，易保存
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25
荧光抗体技术的原理与方法
直接法 间接法 补体法 双标记法
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26
直接法 补体法
间接法 双标记法
精选文档
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18
ELISA技术的原理与方法
间接法
夹心法
竞争法
精选文档
19
间接法
精选文档
20
夹心法
精选文档
21
竞争法
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22
第四节 荧光标记技术
一、常用标记方法 二、标记免疫物的分离与纯化
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23
常用标记方法
1、荧光素的概念
2、生物标记荧光素的要求
3、常用荧光素标记原理与方法
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24
Immunolabeling technique
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1
第一节 免疫标记技术的基本概念
一、免疫标记与标记免疫的概念 二、常用的免疫标记物质
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2
免疫标记与标记免疫
免疫标记技术： 标记物与免疫活性物质的联接技术
标记免疫技术： 以标记免疫物质检测相应靶物质的技术
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3
免疫标记技术 = 免疫技术+ 标记技术
2、125I 的标记方法 直接法（氯胺T法） 间接法（连接法）
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33
标记免疫物的分离与鉴定
1、分离 目的：去除游离放射性核素 方法：柱层析
2、鉴定 游离放射性核素含量 免疫活性 比放射性（m精C选文i档/mg）应用意义 34
第六节 胶体金标记免疫技术 (金标法)
胶体金是由氯化金与还原剂反应形成 的一种胶体颗粒，具有吸附蛋白质的特性 (可以标记Ag或Ab)；
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13
戊二醛交联法（二步法）
COH-（CH2）3-COH + NH2-酶 抗体-NH2 + CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
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14
过碘酸盐氧化法
O O
NaIO4
酶-五炭糖环
O O
O
O
+ NH2抗体
O NaBH4 O
OH N
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用途 免疫组化 免疫分析测定 免疫分析测定
免疫组化 免疫分析测定 免疫分析测定 免疫组化 免疫分析测定 5
第二节 标记免疫技术的分类
一、按指示标记物质划分的类型
二、按测定方式划分的类型
三、按测定用途划分的类型
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6
按指示标记物质划分的类型
1、酶免疫技术 2、荧光免疫技术 3、放射免疫技术 4、金免疫技术
O
抗体
O O
N
抗体
H2O
O O
N
OH
OH
抗体
Schiff碱
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15
标记免疫物的分离与鉴定
源自文库
1、分离
目的：去除游离酶
方法：盐析、柱层析
2、鉴定
抗体活性
酶活性
标记物纯度精选文档
16
酶联免疫吸附实验
enzyme linked immunosorbent assay
（ ELISA ）
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17
ELISA基本的实验过程
125I OH
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30
间接法（连接法）
OH NSHPP
氯胺T
OH 125I
+ Na125I
CH2
O
H-C-C-O-N-C-CH2
H O O=C-C-CH2
CH2
O
H-C-C-O-N-C-CH2
H O O=C-C-CH2
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31
结合相
游离相
放射免疫分析精法选文档的原理与方法 32
常用标记方法
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11
常用标记方法
1、常用酶 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP）
2、标记方法 戊二醛交联法
过碘酸盐氧化法
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12
戊二醛交联法 (一步法）
抗体-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-抗体 酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
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7
按测定方式划分的类型
1、均相型（homogenous） 2、非均相型（heterogeneous）
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8
均相型（homogenous） 非均相型（heterogeneous）
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9
按测定用途划分的类型
1、免疫测定技术 2、免疫组化技术
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10
第三节 酶标记技术
一、常用标记方法 二、标记免疫物的分离与鉴定
胶体金颗粒具有呈色性，中等大小的 胶体金颗粒呈现酒红色。
胶体金标记免疫技术是将金颗粒光学
检测的灵敏性和抗原抗体反应的特异性相
结合。
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35
胶体金免疫法与RIA、ELISA等方 法相比,有许多优点：
1.它不需ELISA法中所要求的作用的底物和显色 剂，使操作更简便;
2.胶体金法无污染，不含危害操作者即污染环境;
抗原抗体反应 特异性
示踪物标记 灵敏性
酶 荧光素 同位素 其它
免疫标记技术的主要特点： 高特异性、高灵敏性
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4
常用的免疫标记物质
类别
标记物
荧光素
FITC、RB200、TRITC
镧系元素螯合物
放射性核素 3H、14C、32P、57Gr
125I、131I
酶
HRP、AP
化学发光物 Luminol、lucigenin 金属颗粒 胶体金、铁蛋白
27
标记免疫物的分离与鉴定
1、分离
目的：去除游离荧光素
方法：柱层析
2、鉴定
抗体活性
标记物结合度
F/P比值的应用意义
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28
第五节 放射性核素标记技术
一、常用标记方法 二、标记免疫物的分离与纯化
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29
直接法（氯胺T法）
-NHCHONH-
CH2
氯胺T
Na125I
4。C
OH
-NHCHONHCH2
3.胶体金标抗体在冻干状态下室温储存较稳定,有 效期长;
4.灵敏度高。
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36
免疫标记技术的比较
FIA
ELISA
RIA
敏感性
较低
高
高
特异性
高
高
高
重复性
差
好
好
检测对象 Ag/Ab
Ag/Ab
Ag
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37
生物标记荧光素的要求
1、具有与蛋白质共价结合的能力 2、荧光效率高 3、能与背景物质形成鲜明对比 4、不影响蛋白质的生物、免疫活性 5、标记方法安全、简便 6、标记物稳定，易保存
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25
荧光抗体技术的原理与方法
直接法 间接法 补体法 双标记法
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26
直接法 补体法
间接法 双标记法
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18
ELISA技术的原理与方法
间接法
夹心法
竞争法
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19
间接法
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20
夹心法
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21
竞争法
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22
第四节 荧光标记技术
一、常用标记方法 二、标记免疫物的分离与纯化
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23
常用标记方法
1、荧光素的概念
2、生物标记荧光素的要求
3、常用荧光素标记原理与方法
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24
Immunolabeling technique
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1
第一节 免疫标记技术的基本概念
一、免疫标记与标记免疫的概念 二、常用的免疫标记物质
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2
免疫标记与标记免疫
免疫标记技术： 标记物与免疫活性物质的联接技术
标记免疫技术： 以标记免疫物质检测相应靶物质的技术
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3
免疫标记技术 = 免疫技术+ 标记技术