瓦氏黄颡鱼(pelteobagrusvachelli)脂肪代谢相关基因cdna的克隆及表达分析

瓦氏黄颡鱼（Pelteobagrus vachelli）脂肪代谢相关基因cDNA的克

隆及表达分析

【摘要】：随着水生动物营养学研究的不断深入和完善,近年来,鱼类的脂类营养已逐渐成为营养学的一个研究热点。迄今不同学者分别从脂类营养与动物的生长性能、生理学参数,以及生化酶和代谢之间的关系等方面做了大量的工作,但从分子水平上,尤其是有关外源营养素与鱼类代谢相关酶基因之间关系的研究仍颇为缺乏。本论文以瓦氏黄颡鱼(darkbarbelcatfish,Pelteobagrusvachelli)为研究对象,主要从分子角度探讨了脂肪种类、水平等对瓦氏黄颡鱼幼鱼生长和脂肪代谢的影响,研究结果可以为完善瓦氏黄颡鱼人工饲料配方和全价配合饲料的开发提供参考。本论文利用分子生物学技术和生物信息学方法,首先克隆了瓦氏黄颡鱼的主要脂肪代谢相关基因肝脂酶(hepaticlipase,HL),脂肪酸结合蛋白(fattyacidbindingprotein,FABP),脂肪酸合成酶(fattyacidsynthase,FAS)和肉碱酰基转运酶(carnitineacetyltransferase,CAT)的cDNA片段,分析了这些基因的cDNA序列和分子特征,以及在不同组织中的表达模式。在此基础上,进行了室内饲养试验,研究了饲料脂肪种类和水平等对瓦氏黄颡鱼生长参数、脂肪代谢相关基因mRNA表达的影响,探讨了它们在机体脂肪的分解、转运,以及体内合成等过程发挥的作用。论文的主要结果和结论如下：1瓦氏黄颡鱼脂肪代谢相关基因的研究本研究根据GenBnak中提供的生物学信息设计简并引物,采用RT-PCR和克隆测

序及生物信息学方法、从瓦氏黄颡鱼肝脏中克隆得到肝脂酶,肝型脂肪酸结合蛋白,心型脂肪酸结合蛋白,脂肪酸合成酶和肉碱酰基转运酶基因的cDNA片段。肝脂酶是血液循环中内源性甘油三酯代谢的关键酶之一。本试验克隆了瓦氏黄颡鱼肝脂酶的部分cDNA序列。该片段长为1065bp序列,软件分析获得了343个氨基酸,其序列与斑马鱼(Daniorerio)、日本鳗鲡(Anguillajaponica)、鳜鱼(Sinipercachuatsi)、斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)、真鲷(Pagrusmajor)的肝脂酶具有很高的同源性,分别为73%、68%、67%、66%和65%。经分析,所得瓦氏黄颡鱼肝脂酶氨基酸残基中含有1个糖基化位点,催化中心三联体位点1个和多肽“盖”等主要的结构功能位点,因而该基因属于脂酶家族。定量PCR分析表明肝脂酶只在肝脏组织中表达,表明瓦氏黄颡鱼肝脂酶的表达具有组织特异性,肝脏是分泌肝脂酶及其行使功能的主要场所。脂肪酸结合蛋白是一类分子量较小,而对脂肪酸有高亲和力的可溶性蛋白质。本试验采用简并引物扩增获得了瓦氏黄颡鱼脂肪酸结合蛋白部分cDNA序列。肝型脂肪酸结合蛋白cDNA片段长为335bp,软件分析获得111个氨基酸残基,与鲤鱼(Cyprinuscarpio)的肝型脂肪酸结合蛋白的氨基酸序列同源性最高,可达到90%。瓦氏黄颡鱼心型脂肪酸结合蛋白cDNA序列片段长为425bp序列,包括26bp3’端非编码区。软件分析后获得114个氨基酸残基,与斜齿鳊(Rutilusrutilus)的心型脂肪酸结合蛋白氨基酸序列同源性高达85%。结果表明克隆所得基因序列均属于脂肪酸结合蛋白家族。定量PCR分析表明,瓦氏黄颡鱼肝型脂肪酸结合蛋白在肝脏、腹腔脂肪、肌肉和心脏组织有较高的

表达量。心型脂肪酸结合蛋白主要在肝脏、脂肪组织和心脏中表达,表明肝脏和腹腔脂肪组织均是肝型和心型脂肪酸结合蛋白表达的主要场所。脂肪酸合成酶能催化机体内脂肪酸的从头合成,生成内源性脂肪酸。本试验采用RT-PCR技术成功分离了瓦氏黄颡鱼脂肪酸合成酶cDNA序列片段,序列长为674bp,软件分析后获得216个氨基酸残基,与斑马鱼(D.rerio)脂肪酸合成酶氨基酸序列同源性最高(87%),其次是红原鸡(Gallusgallus,79%)、南方短尾负鼠(Monodelphisdomestica,70%)、褐家鼠(Rattusnorvegicus,68%)等。定量PCR分析表明,瓦氏黄颡鱼脂肪酸合成酶mRNA在肝脏、肠道、腹腔脂肪、心脏组织的表达水平显著高于肌肉等组织(P0.05),脂肪酸合成酶mRNA的表达量上升,有利于促进脂肪酸的生物合成,以满足不同组织细胞分化增殖对脂质营养和能量的需要。肉碱酰基转运酶属于转运酶家族,能转运从乙酰辅酶A到L-肉碱等酰基基团。本试验获得了瓦氏黄颡鱼肉碱酰基转运酶部分cDNA序列,片段长为494bp,序列软件分析后获得156个氨基酸残基,与斑马鱼(D.rerio)和红原鸡(G.gallus)的肉碱酰基转运酶氨基酸序列同源性分别为81%和70%,分析表明所得序列属于酰基转运酶家族。PCR检测发现瓦氏黄颡鱼肉碱酰基转运酶主要在肝脏、腹腔脂肪组织和肌肉等组织中表达,提示这些组织均为能量代谢的重要场所。瓦氏黄颡鱼肝脂酶、心型脂肪酸结合蛋白、脂肪酸合成酶和肉碱酰基转运酶cDNA片段的成功克隆,为研究瓦氏黄颡鱼脂肪代谢提供了基础资料。根据肝脂酶、心型脂肪酸结合蛋白、脂肪酸合成酶和肉碱酰基转运酶的组织表达特点,后续的生长试验中,

选择了鱼的肝脏和腹腔脂肪组织为目标靶器官,研究了饲料脂肪种类和水平对瓦氏黄颡鱼的生长和脂肪代谢的影响。2饲料脂肪种类对瓦氏黄颡鱼的生长和脂肪代谢相关基因表达的影响研究了饲料中不同脂肪种类对瓦氏黄颡鱼幼鱼生长、主要脂肪代谢相关基因表达的影响。试验以鱼粉和豆粕为蛋白源,分别添加8%的全鱼油、豆油、猪油、混合油1(豆油和鱼油混合=3：1)、混合油2(豆油和鱼油混合=1：3),配制了等氮等能的5种饲料。每组设三重复,投喂初始平均体重约为1.0g的幼鱼80天。结果表明,鱼油、豆油、混合油1和混合油2饲料4个处理组均表现出较好的生长趋势,终末体重和特定生长率分别达到7.67g、7.47g、8.21g、8.31g和2.52%、2.50%、2.65%、2.63%,均显著高于猪油组6.13g和2.32%(P0.05)。饲料脂肪源对瓦氏黄颡鱼的腹腔脂肪率和肝体指数无显著影响,腹腔脂肪率分别为3.52%,4.49%,3.70%,3.92%,4.42%；肝体指数分别为2.66%,2.88%,3.06%,3.08%,2.54%。根据所得的结果,可以认为短期内以豆油作为脂肪源不会显著影响瓦氏黄颡鱼的生长。定量PCR分析主要脂肪代谢相关基因mRNA表达显示,在肝脏组织中,混合油2组的脂蛋白脂酶,肝脂酶,肝型脂肪酸结合蛋白和肉碱酰基转运酶mRNA表达量均显著高于其它组(P0.05)。而猪油组能促进脂肪酸合成酶mRNA 表达上调,且显著高于其它组(P0.05)。同时,在腹腔脂肪组织中,脂蛋白脂酶和肝型脂肪酸结合蛋白mRNA表达具有组织特异性,各组间均无显著差异。混合油1组脂肪酸合成酶表达显著高于鱼油组(P0.05),而其它组间无显著差异。肉碱酰基转运酶mRNA的表达在混合油1和