乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书

乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书-模板

1.目的

采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒核酸的定量检测，或用于乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物治疗中的疗效观察。

2.范围

适用于乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA）定量检测（PCR-荧光探针法）。

3. 职责

3.1 操作人员：负责标本制备检测、仪器操作、报告发送。

3.2 专业组组长：负责本组耗材的请购，监督本组标本检测、仪器操作、报告发送、质控管理等各方面工作。

3.3 实验室主任：负责监督和指导实验室各方面工作。

4. 原理

采用荧光PCR技术，以HBV基因组中相对保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，在样品核酸纯化之后，通过荧光定量PCR对HBV DNA进行扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值(CT)实现对未知样品的检测。另外，本试剂盒带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。

5. 样品要求

5.1 适用样品类型：血清或血浆。

5.2 样品采集：

5.2.1 血清

用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入无菌的真空采血管中（未加抗凝剂），室温（22-25℃）放置30-60min血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500rpm离心5min，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。

5.2.2血浆

用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入含EDTA（乙二胺四乙酸二钠）抗凝剂的真空采血管，立即轻轻颠倒混匀5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5-10min后分离血浆于无菌的1.5ml

灭菌离心管。

5.3 样品保存和运送

使用专用样品0℃冰壶送检，温度约维持在4℃左右。分离后的血清或血浆可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。

5.4 拒收样品：拒绝重度溶血样品、肝素抗凝的血浆。

6. 仪器和试剂

6.1 仪器

AB7500核酸扩增仪、恒温金属浴、生物安全柜、低温离心机等。

6.2 试剂

生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司

产品标准批号：YZB/国7265-2013

线性范围：100 IU/ml-5×108 IU/ml

最低检出限及定量限：最低检出限浓度为30 IU/ml，最低定量浓度为100 IU/ml。

试剂各组分见表1：

表1 试剂盒组分表

7. 操作步骤

7.1 试剂准备（试剂储存和准备区）

7.1.1 进入试剂准备区，打开通风设备，按照消毒清洁程序擦拭实验台面。

7.1.2 取出N个（N=待测样品数+8 =待测样品数+ 4个HCV阳性定量标准品+HCV强阳性质控品+HCV临界阳性质控品+阴性质控品+空白孔）PCR反应管，HBV单人份扩增体系配制如下表2：

表2 反应液配制表

将各组分充分混匀，混合好后进行瞬时离心将管壁上的液体全部离心至管底，之后将30 ul扩增体系分装到PCR反应管，反应液分装时尽量避免产生气泡，盖紧管盖，经传递窗传递到标本制备区。

7.2 DNA提取（标本制备区）

7.2.1 进入标本制备区，从传递窗中取出PCR反应管，将其放入标本制备区冰箱冷藏。

7.2.2 从冰箱取出待测样品、阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品、DNA提取液Ⅰ和内标液，放入生物安全柜内室温溶解，备用。

7.2.3 打开金属浴，调节温度为100℃，使仪器自动升温。

7.2.4 用镊子夹取按需要量准备的1.5 ml灭菌离心管放于安全柜内离心管架上，所需离心管数为样品数+8。

7.2.5向离心管中各加入450 ul DNA 提取液Ⅰ和4 ul内标溶液，再按编号加入200 ul样品，离心管与样品对应编号，每个离心管的编号方向都要朝向管口开启的方向。用振荡器剧烈震荡混匀15s，瞬时离心数秒。

7.2.6将离心管放入金属浴，100℃恒温处理10±1 min。（摆放离心管时，离心管开口要背向人放置。）7.2.7 温育10min后，用镊子从金属浴中取出所有离心管，室温静置冷却。12000g，离心5min，备用。（摆放离心管时要将离心管开口朝向内侧。）

7.2.8 从标本制备区冰箱冷藏室取出分装好的HBV DNA PCR反应管，向对应编号的PCR管中加入处理好的的样品（包括样品、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品）上清液各20 ul，空白对照不加模板，盖紧反应管。8000rpm离心数秒，经传递窗移至扩增检测区。（用移液枪小心吸取上清液，尽量不要碰到底层沉淀。）

7.3 PCR扩增（扩增区）

7.3.1 从传递窗中取出PCR反应管，放入仪器样品槽内。

7.3.2 按对应顺序设置空白管、阴性质控品、阳性室内质控品、临界阳性质控品、阳性定量参考品及待测样品，并在“sample name”一栏中设置样品名称，探针检测模式设置：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye1：none；Reporter Dye2：VIC，Quencher Dye2：none；Passive Reference：Rox。具体设置方法参考《AB 7500核酸扩增仪标准作业指导书》。

7.3.3 打开Run窗口设置循环条件：

93℃ 2 min；

93℃ 45 s → 55℃ 60 s，10个循环；

93℃ 30 s → 55℃ 45 s，30 个循环。

7.3.4 保存文件，运行仪器。

8. 结果分析

8.1 反应结束后，操作人员可根据实际情况自行调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值。Start值可以在3-15，End值可设在5-20。在Log图谱窗口设置的Threshold的Value值，使基线位于扩增曲线指数期，调整阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线，点击Analysis自动获得分析结果在Report界面查看结果，记录样品数值（C）。

8.2 如果在FAM检测通道扩增曲线无明显对数增长期或CT值等于30，在VIC检测通道扩增曲线有对数增长期，则判定样品的HBV DNA浓度小于检测灵敏度。

8.3 如果在FAM检测通道扩增曲线有对数增长期且CT值小于30，则按以下方法判断：

（1）若样品的C﹤100，则样品的HBV DNA浓度﹤100IU/ml；

（2）若样品的100﹤C﹤5.0E+008，则样品的HBV DNA浓度＝C IU/ml；

（3）若样品的＞5.0E+008，则样品的HBV DNA浓度＞5×108 IU/ml；如需要精确定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后在检测。则该样品的HBV DNA浓度＝（C×稀释倍数）IU/ml。

9. 质量控制

每次实验均需检测阴性质控品、HBV 强阳性质控品、HBV临界阳性质控品。质控品结果满足质量控制要求时方可进行检测结果的判断。

9.1 试剂盒自带质控

（1）阴性质控品：FAM检测通道扩增曲线无明显对数增长期或CT值＝30，VIC检测通道扩增曲线为明显对数增长期；

（2）HBV 阳性质控品：FAM检测通道扩增曲线有明显对数增长期且CT值＜30，强阳性质控