考染和银染单点鉴定

方法：质谱法
原理：
一、利用MALDI-TOF质谱仪
根据肽质量指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting, PMF)与蛋白质数据库中蛋白质的理论PMF比对，就可以鉴定该蛋白质。

优点：
速度快，通量高，方法简便。

缺点：
灵敏度不足，可检测到的肽段少，对数据库检索是不利的。

肽段分子量精确度往往不够理想，影响鉴定结果。

肽段分子质量在2000以上时，在MALDI-TOF-MS中
的分辨率会有所下降。

蛋白质数据库仍不完善。

二、利用ESI-MS质谱仪
由于MS/MS具有结构分析功能，可以获得检测到的每一肽段的序列。

根据一级质谱(MS)测得的精确分
子质量和串联质谱(MS/MS)所得的序列信息，通过蛋白质数据库的检索鉴定蛋白质种类。

优点：
通过串联质谱大大增加了蛋白质鉴定的准确性。

对图谱的精确度和分辨率要求不如PMF高。

采用纳升喷雾提高检测的灵敏度。

缺点：
通量与速度不如MALDI。

数据库检索比较费时。

仪器：
BrukerAutoflex Ⅱ（MALDI-TOF-TOF-MS）；Finnigan LCQ Deca Xp / Finnigan LTQ
样品要求：
1、防止角蛋白污染
2、样品状态：液体、固体或胶内蛋白质（接受考马斯亮兰染色和银染样品鉴定）
3、含盐量：挥发性无机盐< 20 mM; 不挥发性无机盐< 5mM
4、不少于200 ug /一块胶（银染）；
5、胶内蛋白质鉴定，蛋白质样品量不少于1mg/一块胶（考马斯亮兰染色）
蛋白质鉴定结果常见问题：
1、由于角蛋白等蛋白质的污染，造成鉴定为污染蛋白。

2、由于蛋白量过少引起鉴定结果的评分低，可信度不高。

3、由于蛋白质纯度不足，造成鉴定结果为混合蛋白质。

4、由于蛋白质为未知蛋白，造成鉴定无结果。

注意事项：
1、推荐采用考马斯亮兰染色。

因为该方法的成功率较高，而银染的成功率则会低很多。

2、银染的方法为快速银染法。

常规银染法不适用质谱鉴定。

3、考马斯亮蓝染色样品的上样量>1mg
4、银染法得上样量>0.6mg。