考染与银染
双向电泳中4种常用染色方法的比较
取、 等电聚焦、 白质转移、Ｄ Ｐ Ｇ 蛋 Ｓ Ｓ— Ａ Ｅ电泳以及染色等
环节 ， 个环节 又包括 若 干步骤 。由此可 见 ２一 Ｅ技 每一 Ｄ
术是一个受多种因素控制的技术 ， 中任何一种因素没 其
有理 想地控 制好都 有 可能 引起 整 个 实验 的失 败 ， 且 这 而 种失 败往往 要等 到 ２一 Ｅ图谱染 色 显影 之后才 能 看 到。 Ｄ 因此 ， ２一 Ｅ中 ， 得到 一张理 想 的 图谱 果 进 行 了对 比 ， 筛 选 出适 合 以期 本 实验室 条件 的染色方 法 。
１ 材 料 与方 法
１１ 试 验材料 ． 本 实验 所用 的研 究 材料 为 杂交 水 稻威 优 ９６ １。本实 验染色 所涉及 的试 剂 ： 硝酸 银 （ 上海 试 剂一
的质谱分析提供有益的帮助， 除了控制好每一个步骤外 ，
摘
要： 采用 Ｓ Ｓ— Ａ Ｅ电泳技术 ， Ｄ ＰＧ 比较分析 了双向 电泳 中常 用４种染 色方 法的优、 点。结果表 明： 缺 常规银 染法灵敏
度低 ； 的双胺硝酸银银 柒法与质谱 分析不兼容 ； 染方法 一银 染复合染 色法的灵敏度稍低 于双胺硝酸银银 染法， 它的 改进 考 但 质谱 兼容性最高； 改进后的银 染方法灵敏度 高、 背景 清晰、 与质谱 兼容。因此后两种 方法较广泛适用于蛋 白质组学研究。
技术具 有高分 辨率 、 重 复 性 、 量分 析 和制 备 等性 能 ， 高 微
它与质谱分析是 当今蛋 白质组学研究 中必不可少的工
具 。２ Ｄ 一 Ｅ技术所 涉及 的环节 较 多 ， 一般 包 括 蛋 白质 提
及实验条件的差异， 同一染色方法往往在不同的实验室
考染与银染资料
常用的蛋白质染色试剂分为已考马斯亮蓝为代表的有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。
其中考马斯亮蓝染色法的应用较为广泛，现将其与其他的蛋白质染色方法(主要是银染法)作一比较，帮助大家更好地去选择合适的蛋白质染色方法。
蛋白质的染色常用的有4类：有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。
其中有机试剂染色以考马斯亮蓝染色法(Coomasie brilliant blue ，CBB)为代表，在蛋白质分析中常用，但对低丰度蛋白质的显现较差;银染灵敏度虽高，却常与质谱不兼容；荧光染色以SYPRO试剂为主，蛋白质检测灵敏度高，能兼容质谱，但由于需要配备特殊的检测仪器及试剂的昂贵，未被作为常规方法使用；而同位素显色则存在安全性和操作局限性等问题。
因此，筛选简便、节约、检测灵敏度高、质谱兼容的蛋白质着色法是蛋白质组研究所需。
由于考马斯亮蓝染色法的广泛运用，近年来就考马斯亮蓝染色法在提高其灵敏性方面研究者们作了许多改进，方法众多，评价不一。
我们在作双向凝胶电泳时，将常用的几种考马斯亮蓝染色法及银染进行了比较，并就其染色影响因素作岀分析。
试剂固相pH 梯度干胶条(IPG strip pH3-10NL , IPG strip pH5-8 , 17cm )、urea、CHAPS、TBP、DTT、Bio-Lyte裂解，静置30分钟，15500X g离心30分钟，取上清，进行蛋白质定量。
单向定量电泳取蛋白质分子量标准物，第一次按1 : 2稀释后，以后按1 : 3倍比例逐级稀释，经4级稀释后，取15卩l 上样液上样，性半乳糖苷酶上样量依次分别为1川、0.24 tig 0.062 tig、0.0156 0.004 心作12g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶单向电泳，同时电泳4份胶，显色以确定染色灵敏度。
双向电泳取3001样品液沿水化盘中槽的边缘自左向右线性加入，将17cm IPG胶条胶面朝下置于槽中，静置45分钟后覆盖矿物油，在20 C溶胀11〜16小时。
银染
快速银染试剂盒Protein Stains Q产品编号：BSP029S-N包装规格：50 Assays产品简介银染是灵敏度较高的一种染色法，是对各种凝胶中的蛋白质进行染色时最常用的方法。
它通过被还原银离子在蛋白质上形成黑色来指示蛋白区带的。
银染的灵敏度比考马斯亮蓝染色高100倍，可以检测低于2 ng的蛋白质。
本试剂盒在保证检测灵敏度的同时，还具有操作方便快速的优点，可在1小时内完成1块凝胶的银染。
运输和保存条件在常温下运输，收到后，将所有试剂放置在2-8°C的环境中保存，保质期一年。
产品组成成份BSP029-NBSP029S-N-1溶液A 300 ulBSP029S-N-2溶液B 20 x 10 mlBSP029S-N-3干粉0.2 gBSP029S-N-4溶液D 5 x 40 mlBSP029S-N-5溶液E 10 ml注意:使用前将干粉用10ml的双蒸水溶解成20倍浓缩的溶液C,再按照需要的体积,稀释为1倍浓度.使用方法1. 取出电泳后的聚丙烯酰胺凝胶，用蒸馏水冲洗凝胶,根据以下程序所需要的试剂量,取一定体积的溶液B2. 和D，用双蒸水稀释成1倍的溶液后再使用.3. 加入20 ml蒸馏水，置于摇床上，震荡5 min。
4. 倾出蒸馏水，加入40%的甲醇20 ml和10 ul溶液A，置于摇床上，震荡10 min。
5. 倾出溶液A，加入20 ml蒸馏水，置于摇床上，震荡5 min，重复1次。
6. 倾出蒸馏水，加入20 ml溶液B，置于摇床上，震荡5 min。
7. 倾出溶液B，加入20 ml蒸馏水，置于摇床上，震荡20s，重复1次。
8. 倾出蒸馏水，加入20 ml溶液C，置于摇床上，震荡10 min。
9. 倾出溶液C，加入20 ml蒸馏水，置于摇床上，震荡1 min.10. 倾出蒸馏水，加入20 ml溶液D和10 ul溶液A，缓慢摇动，直至蛋白质条带具有足够的显色强度（约30 s-1 min）。
蛋白考染流程
蛋白考染流程蛋白质是生物体内最基本的组成部分之一，它在细胞的结构和功能中起着重要的作用。
为了研究蛋白质的结构和功能，科学家们发展了许多蛋白质染色的方法，其中最常用的一种是蛋白质的考染流程。
本文将介绍蛋白质考染的基本流程和相关的实验操作。
蛋白质考染的基本流程可以分为样品制备、染色、显微观察和结果分析等几个步骤。
样品制备是蛋白质考染的关键步骤之一。
通常，我们需要从生物体中提取蛋白质样品。
提取方法可以根据不同的实验目的进行选择，常用的方式包括细胞裂解、组织切片和蛋白质纯化等。
提取得到的样品应该保存在适当的条件下，以保持蛋白质的稳定性和活性。
接下来，染色是蛋白质考染流程中的核心步骤。
常用的蛋白质染色方法有几种，包括银染、荧光染和共染等。
银染是一种常用的染色方法，它通过将蛋白质与银离子反应生成可见的银颗粒，从而达到染色的目的。
荧光染色是利用特定的荧光染料与蛋白质结合，并利用荧光显微镜观察染色结果。
共染是将蛋白质与核酸同时染色的方法，可以用于同时观察蛋白质和核酸的位置和分布。
完成染色后，我们需要使用显微镜观察染色结果。
显微观察是蛋白质考染流程中的重要环节，通过观察染色样品的形态和颜色变化，可以初步判断蛋白质的存在和分布情况。
同时，也可以通过显微观察来定量分析染色结果，比如计算染色的强度和分布密度等。
结果分析是蛋白质考染流程中的最后一步。
在结果分析中，我们需要对染色结果进行定量和定性的分析。
定量分析可以通过图像处理软件来完成，比如计算染色的强度和面积等参数。
定性分析则是根据染色结果的特点和分布情况，来推测蛋白质的功能和作用。
总结起来，蛋白质考染流程是一个系统而复杂的实验过程，包括样品制备、染色、显微观察和结果分析等步骤。
通过这个流程，我们可以研究蛋白质的结构和功能，揭示生物体内蛋白质的分布和作用机制。
蛋白质考染的方法和技术也在不断发展和改进，为科学家们提供了更多的工具和手段来研究蛋白质。
希望本文对蛋白质考染流程的理解和实验操作有所帮助。
银染方法总结
银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有100 多种。
大致的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。
由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于1 ng/蛋白质点，故广泛的用在2D 凝胶分析上，及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。
这里介绍的是我们实验室成功运用的银染方法，主要是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋白的检测！如内源性GST-Pulldown、Co-IP等实验中相互作用蛋白的研究银染操作规程实验原理：在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。
染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。
试剂：乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或EDTA.Na2.2H2O、甲醛实验操作程序：固定：30min或者更长时间100ml 乙醇（40% 乙醇）25ml冰醋酸（10% 冰醋酸）加水到250ml致敏：30min75ml 乙醇（30% 乙醇）17g乙酸钠或28.2g三水乙酸钠0.5g硫代硫酸钠加水到终体积250ml 水洗：3 x 10min银染：20min0.625g AgNO3、100 ul 37%甲醛（在使用前加入）加水到终体积250ml水洗：2 x 1 min (注意把握时间，水洗时间长显色速度慢，点的颜色偏黄色)显色：视情况而定6.25 g Na2CO3、50 ul 37% 甲醛（在使用前加入）加水到终体积250ml终止：10min3.65g EDTA.Na2.2H2O 或者1g 甘氨酸加水到终体积250ml保存：1% 冰醋酸，4 ℃注意事项：1．固定时间较长，则加一步水洗30min，以免胶太脆而破碎。
2．甲醛在使用前加入。
3．最好多配制一份显色液，第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液，显色到点清晰。
4．显色过程很快，要注意把握时间，避免染色过度。
5．银染液和显色液需要预冷。
考染与银染
常用的蛋白质染色试剂分为已考马斯亮蓝为代表的有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。
其中考马斯亮蓝染色法的应用较为广泛，现将其与其他的蛋白质染色方法（主要是银染法）作一比较，帮助大家更好地去选择合适的蛋白质染色方法。
蛋白质的染色常用的有4类：有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。
其中有机试剂染色以考马斯亮蓝染色法（Coomasie brilliant blue，CBB）为代表，在蛋白质分析中常用，但对低丰度蛋白质的显现较差;银染灵敏度虽高，却常与质谱不兼容;荧光染色以SYPRO试剂为主，蛋白质检测灵敏度高，能兼容质谱，但由于需要配备特殊的检测仪器及试剂的昂贵，未被作为常规方法使用;而同位素显色则存在安全性和操作局限性等问题。
因此，筛选简便、节约、检测灵敏度高、质谱兼容的蛋白质着色法是蛋白质组研究所需。
由于考马斯亮蓝染色法的广泛运用，近年来就考马斯亮蓝染色法在提高其灵敏性方面研究者们作了许多改进，方法众多，评价不一。
我们在作双向凝胶电泳时，将常用的几种考马斯亮蓝染色法及银染进行了比较，并就其染色影响因素作出分析。
试剂固相pH梯度干胶条（IPG strip pH3-10NL，IPG strip pH5-8，17cm）、urea、CHAPS、TBP、DTT、Bio-Lyte 3/10 Ampholyte、IAM、SDS、Tris、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、CBB-G250均为BIO-RAD公司产品。
硫酸铵及磷酸均购自成都科龙试剂厂。
AgNO3为Sigma公司出品。
Protein molecular weight marker #SW0431为MBI公司出品。
甲醛、Na2S2O3与Na2CO3分别为成都天华科技股份有限公司、重庆北碚化学试剂厂和天津市塘沽鹏达化工厂产品。
仪器IPGphor等电聚焦仪、proTEANⅡ垂直电泳仪、Power PAC1000电泳仪、加样溶胀槽、GS-800 Calibrated Densitometer扫描仪、PDQuest凝胶图像分析软件均为BIO-RAD公司产品。
考染和银染单点鉴定
方法：质谱法原理：一、利用MALDI-TOF质谱仪根据肽质量指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting, PMF)与蛋白质数据库中蛋白质的理论PMF比对，就可以鉴定该蛋白质。
优点：速度快，通量高，方法简便。
缺点：灵敏度不足，可检测到的肽段少，对数据库检索是不利的。
肽段分子量精确度往往不够理想，影响鉴定结果。
肽段分子质量在2000以上时，在MALDI-TOF-MS中的分辨率会有所下降。
蛋白质数据库仍不完善。
二、利用ESI-MS质谱仪由于MS/MS具有结构分析功能，可以获得检测到的每一肽段的序列。
根据一级质谱(MS)测得的精确分子质量和串联质谱(MS/MS)所得的序列信息，通过蛋白质数据库的检索鉴定蛋白质种类。
优点：通过串联质谱大大增加了蛋白质鉴定的准确性。
对图谱的精确度和分辨率要求不如PMF高。
采用纳升喷雾提高检测的灵敏度。
缺点：通量与速度不如MALDI。
数据库检索比较费时。
仪器：BrukerAutoflex Ⅱ（MALDI-TOF-TOF-MS）；Finnigan LCQ Deca Xp / Finnigan LTQ样品要求：1、防止角蛋白污染2、样品状态：液体、固体或胶内蛋白质（接受考马斯亮兰染色和银染样品鉴定）3、含盐量：挥发性无机盐< 20 mM; 不挥发性无机盐< 5mM4、不少于200 ug /一块胶（银染）；5、胶内蛋白质鉴定，蛋白质样品量不少于1mg/一块胶（考马斯亮兰染色）蛋白质鉴定结果常见问题：1、由于角蛋白等蛋白质的污染，造成鉴定为污染蛋白。
2、由于蛋白量过少引起鉴定结果的评分低，可信度不高。
3、由于蛋白质纯度不足，造成鉴定结果为混合蛋白质。
4、由于蛋白质为未知蛋白，造成鉴定无结果。
注意事项：1、推荐采用考马斯亮兰染色。
因为该方法的成功率较高，而银染的成功率则会低很多。
2、银染的方法为快速银染法。
常规银染法不适用质谱鉴定。
3、考马斯亮蓝染色样品的上样量>1mg4、银染法得上样量>0.6mg。
PAGE银染方法
TA钠盐或者1g甘氨酸加去离子水到终体积250ml。 浸泡凝胶10min。 9．保存 1%冰醋酸，4℃。 1．银染主要出现在胶的表面，用薄胶（0.5-0.7
5mm）可以提高灵敏度。 2．固定时间较长，则加一步水洗30min，以免胶 太脆而破碎。 3．最好多配制一份显色液，第一次显色到溶液 变混浊时换一份显色液，显色
由于其成本低，所用试剂安全、快速、灵敏度高 而被广泛应用。银染的原理是银离子在碱性pH环 境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而 显色。由于银染的灵敏度很高，可染
出凝胶上低于1ng/蛋白质点，故广泛的用在2D凝 胶分析上，及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。 这里介绍的是一种实验室常用的银染方法，主要 是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋
．室温操作，温度的波动往往会干扰银染的效果， 恒温水浴可以解决这个问题。 14．当蛋白质中含有核酸或金属时，银染则不会 奏效。改变固定剂和染色之前对胶进行漂洗可以
改进染色效果。 15．据称戊二醛预处理可以使各种蛋白质的染色 提高40倍。在染色效果不佳的情况下可以考虑。 16．银染应尽快照相，随着时间延长，蛋白条带 会变浅
，而背景会加深。 17．不同蛋白质对银染反应不一样，尤其是碱性 蛋白染色效果差。因此不宜用银染测定不同蛋白 的比例。
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致在60KDa或67KDa处出现两条水平线。减少巯 基乙醇的用量即可避免。。 8．染色、水洗等过程中，缓慢的振荡是必要的， 一般选择40-60rpm。没有设备，用
手推轻晃亦可。 9．凝胶表面的裂纹多是由于压力、手印及表面 干燥所致，所以全程操作中都应带手套。 10．凝胶背景呈均一的黑色多是水中的杂质引起 的，所以溶液的配
考马斯亮蓝染色的原理和方法
考马斯亮蓝染色的原理和方法在蛋白质染色方法中，目前以考马斯亮蓝染色最为常用。
因为它既克服了氨基黑染色灵敏度不高的限制，又比银染简便易操作。
考染的历史考马斯亮蓝染色最早由Fazekas等在1963年用于醋酸纤维素膜电泳，并认为同样可用于纸电泳，琼脂糖电泳和淀粉凝胶电泳。
1965年Meyer等将此方法应用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。
考染的灵敏度考马斯亮蓝染色可以达到0.2~0.5 μg（200~500 ng），最低可检出0.1 μg蛋白；银染的灵敏度比考染高将近100倍，最低可以检出2 ng蛋白。
通过考染条带的深浅粗细，可以大致判断该条带有多少蛋白，如在8.6×6.8 cm（W×L）?.75 mm厚的胶上15~20 μg蛋白大约是下面这样的条带：考马斯亮蓝染料的种类考马斯亮蓝分为R-150、R-250、R-350、G-250等。
其中R-350最为灵敏，R为红蓝色，G 为绿蓝色。
R-250即三苯基甲烷，每个分子含有两个SO3H基团，偏酸性，与氨基黑一样也是结合到蛋白质的碱性基团上。
G-250即二甲花青亮蓝，是一种甲基取代的三苯基甲烷。
推荐一种考染的方法⑴电泳后的凝胶立即浸泡在固定液（500 ml 乙醇，100 ml 冰醋酸，400 ml 蒸馏水）中至少30 min，如有必要可在固定液中浸泡过夜；⑵将固定后的凝胶在热的染色液（0.29 g 考马斯亮蓝溶解在250 ml 脱色液中，在使用前边搅拌边加热至60℃）中浸泡10min，然后用蒸馏水将凝胶淋洗一次；⑶多次变换脱色液（250 ml 乙醇，80 ml冰醋酸，加蒸馏水至1 L），直至凝胶背景脱净为止，为加快脱色，可略加温度；以上各步最好用振荡器（摇床）震荡染色皿。
⑷为了防止凝胶干燥后的龟裂，脱去背景色的凝胶在保存液（25 ml 87% 甘油加225 ml 脱色液）中浸泡30min。
然后将凝胶放在玻璃板上，再用保存液浸湿玻璃纸包住凝胶在室温下晾干。
蛋白质银染原理与方法
原理：蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合，检测极限是2～5.0ng／蛋白条带。
① SDS-PAGE电泳。
注意：银染检测蛋白质的水平是在100ng左右，与CommassieBlue染色比较，银染加样量要少。
否则难以得到清晰的电泳分辨率。
②电泳结束后，戴手套将PAGE胶转移到干净的玻璃培养皿或TIP头盒盖中。
加入25ml FixingSolution（固定液），室温振荡保温30min。
胶需要完全淹没在固定液中。
③彻底弃去固定液，加入25mlIncubation Solution（保育液），室温振荡保温30min。
胶需要完全淹没在保育液中。
④彻底弃去IncubationSolution（保育液），用50ml去离子水洗3次，每次5min。
⑤准备：取2.5ml 10XSilvering Solution, 加入22.5mL水，混匀后使用。
⑥弃去洗涤的水，加入25mlSilvering Solution (银染液)。
室温振荡保温20min。
⑦彻底弃去银染液，加入25mLDevelopingSolution（显色液），室温振荡保温1~10min。
注意观察目的条带。
如果目的条带出现了，可以考虑终止显色。
显色时间不要过长，否则本底较深。
⑧彻底弃去显色液,加入25mLStopping Solution（终止液），室温振荡保温10min。
⑨彻底弃去StoppingSolution（终止液），用50mL去离子水洗3次，每次5min。
弃去洗涤的水，加入25mL PreservingSolution（保护液），室温振荡保温20min。
银染PAGE胶可以拍照保存，也可以室温玻璃纸干燥。
今天第一次银染，结果出来啥也没有，凝胶就像一块海带一样。
能不能提供详细的银染步骤呢？好像有好几种版本，哪位大侠有经验的希望能点拨一下？hotstoe wrote:1. 取下凝胶,蒸馏水冼胶30秒.2. 0.1% 硝酸银染色10分钟.3. 弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟.4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.显色液配方: 10克氢氧化钠+0.2克碳酸钠+2m甲醛溶液,定溶到500ml.这个染色方法挺好的,我用过.注意染色时间不能长.我的经验是：1.取下凝胶用去离子水冼胶30秒三次，2.0.1% 硝酸银染色10分钟.3.弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟（换2次去离子水）4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.不要试图将所有的条带都显出来，要求越高可能导致背景就深，5.染色后要用固定液（冰乙酸）终止染色，6.固定3分钟后再用去离子水洗涤2遍（整个试验比较费去离子水）。
银染经验谈
银染是一种常用的蛋白质染色方法，具有较高的灵敏度，可以染出SDS-PAGE胶中含量低至0.2ng的蛋白。
虽然这是protocol上的说法，但如果操作得当，检测到5ng左右的蛋白应该不成问题。
如果搜索银染的protocol，可能会得到许多种说法。
为什么这样一种重要的实验手段却得不到统一的应用呢？这可能要从银染本身那复杂而又灵活的原理说起。
简单的讲，银染的原理就是将银离子还原，附着在蛋白表面，形成染色。
银染所用的银，基本上是基于两种试剂，一种是硝酸银，另一种是Silver diammine。
基于硝酸银的应用要多于后者（据说Silver diammine比较费“银子”），现在主要说说基于硝酸银的银染的原理。
银离子容易被还原，在PAGE胶上，哪里的银离子先开始被还原，哪里就先开始出现条带。
通常由于蛋白质结构上的复杂性，一部分银离子结合在蛋白质之上后会影响更多银离子的结合，所以有蛋白的地方银离子较少，如果不做任何处理，有蛋白的部位将会染色更浅，所以最初的银染是负染。
那最初的负染是如何演变成正染色的呢？一方面是选用还原速度较慢的还原剂，如甲醛，另一方面，利用慢还原争取到的时间将胶上多余的银离子洗去，由于银离子对蛋白质有一定的结合力，故更多地保留在有蛋白的位置，于是形成了正染。
但是这种染色的方法灵敏度还不是很高，所以人们又在染色之前加入了敏化的步骤，能够使银染敏化的试剂很多，一类是增加蛋白质与银离子的结合位点，如SDS等；还有一类能使银离子和蛋白形成silver sulfide等结合，硫代硫酸盐起到的就是这个作用；还有的试剂兼顾上述两种功能，如戊二醛。
通过敏化过程，银染的灵敏度大大增加，同时也降低了背景。
综上，银染的原理概括如下：让银离子尽可能多的于蛋白结合，尽可能的洗掉胶上的银离子，然后还原显色。
各种各样的protocol基本上都是基于这个原理。
最为经典的一个版本是这样的：谈谈其中一些具体步骤：1. 固定，固定的作用主要是使蛋白变性，防止蛋白在扩散2. 敏化，戊二醛和硫代硫酸钠都是增加蛋白和银离子的结合，但是做质谱兼容银染的时候一般都把戊二醛去掉，原因是对蛋白造成修饰（在我的实验中，有戊二醛存在的时候一般也能鉴定到蛋白，不知道是不是去掉更好）。
蛋白质银染原理与方法
原理：蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合，检测极限是2～／蛋白条带。
① SDS-PAGE电泳。
注意：银染检测蛋白质的水平是在100ng左右，与CommassieBlue染色比较，银染加样量要少。
否则难以得到清晰的电泳分辨率。
②电泳结束后，戴手套将PAGE胶转移到干净的玻璃培养皿或TIP头盒盖中。
加入25ml FixingSolution（固定液），室温振荡保温30min。
胶需要完全淹没在固定液中。
③彻底弃去固定液，加入25mlIncubation Solution（保育液），室温振荡保温30min。
胶需要完全淹没在保育液中。
④彻底弃去IncubationSolution（保育液），用50ml去离子水洗3次，每次5min。
⑤准备：取10XSilvering Solution, 加入水，混匀后使用。
⑥弃去洗涤的水，加入25mlSilvering Solution (银染液)。
室温振荡保温20min。
⑦彻底弃去银染液，加入25mLDevelopingSolution（显色液），室温振荡保温1~10min。
注意观察目的条带。
如果目的条带出现了，可以考虑终止显色。
显色时间不要过长，否则本底较深。
⑧彻底弃去显色液,加入25mLStopping Solution（终止液），室温振荡保温10min。
⑨彻底弃去StoppingSolution（终止液），用50mL去离子水洗3次，每次5min。
弃去洗涤的水，加入25mL PreservingSolution（保护液），室温振荡保温20min。
银染PAGE胶可以拍照保存，也可以室温玻璃纸干燥。
今天第一次银染，结果出来啥也没有，凝胶就像一块海带一样。
能不能提供详细的银染步骤呢？好像有好几种版本，哪位大侠有经验的希望能点拨一下？hotstoe wrote:1. 取下凝胶,蒸馏水冼胶30秒.2. % 硝酸银染色10分钟.3. 弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟.4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.显色液配方: 10克氢氧化钠+克碳酸钠+2m甲醛溶液,定溶到500ml.这个染色方法挺好的,我用过.注意染色时间不能长.我的经验是：1.取下凝胶用去离子水冼胶30秒三次，硝酸银染色10分钟.3.弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟（换2次去离子水）4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.不要试图将所有的条带都显出来，要求越高可能导致背景就深，5.染色后要用固定液（冰乙酸）终止染色，6.固定3分钟后再用去离子水洗涤2遍（整个试验比较费去离子水）。
两大蛋白质染色主流方法大比较
两大蛋白质染色主流方法大比较日期：2012-05-31 来源：未知标签：考马斯亮蓝银染法蛋白质染色摘要: 常用的蛋白质染色试剂分为已考马斯亮蓝为代表的有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。
其中考马斯亮蓝染色法的应用较为广泛，现将其与其他的蛋白质染色方法(主要是银染法)作一比较，帮助大家更好地去选择合适的蛋白质染色方法。
蛋白质的染色常用的有4类：有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。
其中有机试剂染色以考马斯亮蓝染色法(Coomasie brilliant blue，汉恒生物--慢病毒腺病毒免费试用申请入口汉恒生物--腺相关病毒（动物体内转染神器）免费试用申请入口恩必美生物新一轮2-5折生物试剂大促销！常用的蛋白质染色试剂分为已考马斯亮蓝为代表的有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。
其中考马斯亮蓝染色法的应用较为广泛，现将其与其他的蛋白质染色方法(主要是银染法)作一比较，帮助大家更好地去选择合适的蛋白质染色方法。
蛋白质的染色常用的有4类：有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。
其中有机试剂染色以考马斯亮蓝染色法(Coomasie brilliant blue，CBB)为代表，在蛋白质分析中常用，但对低丰度蛋白质的显现较差;银染灵敏度虽高，却常与质谱不兼容;荧光染色以SYPRO 试剂为主，蛋白质检测灵敏度高，能兼容质谱，但由于需要配备特殊的检测仪器及试剂的昂贵，未被作为常规方法使用;而同位素显色则存在安全性和操作局限性等问题。
因此，筛选简便、节约、检测灵敏度高、质谱兼容的蛋白质着色法是蛋白质组研究所需。
由于考马斯亮蓝染色法的广泛运用，近年来就考马斯亮蓝染色法在提高其灵敏性方面研究者们作了许多改进，方法众多，评价不一。
我们在作双向凝胶电泳时，将常用的几种考马斯亮蓝染色法及银染进行了比较，并就其染色影响因素作出分析。
试剂固相pH梯度干胶条(IPG strip pH3-10NL，IPG strip pH5-8，17cm)、urea、CHAPS、TBP、DTT、Bio-Lyte 3/10 Ampholyte、IAM、SDS、Tris、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、CBB-G250均为BIO-RAD公司产品。
考染与银染
常用的蛋白质染色试剂分为已考马斯亮蓝为代表的有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。
其中考马斯亮蓝染色法的应用较为广泛，现将其与其他的蛋白质染色方法（主要是银染法）作一比较，帮助大家更好地去选择合适的蛋白质染色方法。
蛋白质的染色常用的有4类：有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。
其中有机试剂染色以考马斯亮蓝染色法（Coomasie brilliant blue,CBB)为代表，在蛋白质分析中常用，但对低丰度蛋白质的显现较差;银染灵敏度虽高，却常与质谱不兼容；荧光染色以SYPRO试剂为主，蛋白质检测灵敏度高,能兼容质谱，但由于需要配备特殊的检测仪器及试剂的昂贵,未被作为常规方法使用;而同位素显色则存在安全性和操作局限性等问题。
因此，筛选简便、节约、检测灵敏度高、质谱兼容的蛋白质着色法是蛋白质组研究所需.由于考马斯亮蓝染色法的广泛运用，近年来就考马斯亮蓝染色法在提高其灵敏性方面研究者们作了许多改进，方法众多，评价不一。
我们在作双向凝胶电泳时，将常用的几种考马斯亮蓝染色法及银染进行了比较，并就其染色影响因素作出分析。
试剂固相pH梯度干胶条（IPG strip pH3-10NL,IPG strip pH5-8，17cm）、urea、CHAPS、TBP、DTT、Bio-Lyte 3/10 Ampholyte、IAM、SDS、Tris、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、CBB-G250均为BIO—RAD 公司产品.硫酸铵及磷酸均购自成都科龙试剂厂.AgNO3为Sigma公司出品。
Protein molecular weight marker #SW0431为MBI公司出品.甲醛、Na2S2O3与Na2CO3分别为成都天华科技股份有限公司、重庆北碚化学试剂厂和天津市塘沽鹏达化工厂产品。
仪器IPGphor等电聚焦仪、proTEANⅡ垂直电泳仪、Power PAC1000电泳仪、加样溶胀槽、GS-800 Calibrated Densitometer扫描仪、PDQuest凝胶图像分析软件均为BIO-RAD公司产品。
装片染色方法
装片染色方法在生物学和医学领域中，装片染色是一种常用的实验技术，用于观察细胞和组织的微观结构。
本文将详细介绍几种常见的装片染色方法，以供参考。
一、苏木精-伊红染色（H&E染色）1.装片准备：将固定好的组织样本切成薄片，粘贴在载玻片上。
2.染色步骤：a.使用苏木精染液对装片进行初染，约5-10分钟。
b.用清水冲洗，去除多余染料。
c.使用1%的盐酸酒精分化，约30秒。
d.用清水冲洗，去除多余分化液。
e.使用伊红染液复染，约1-3分钟。
f.用清水冲洗，去除多余染料。
g.晾干装片，进行显微镜观察。
二、免疫荧光染色1.装片准备：将细胞或组织样本固定在载玻片上。
2.染色步骤：a.使用适当浓度的封闭液，室温封闭1小时。
b.加入一抗，室温或4℃孵育过夜。
c.用PBST（磷酸盐缓冲液+吐温-20）清洗装片，重复3次。
d.加入荧光二抗，室温孵育1小时。
e.用PBST清洗装片，重复3次。
f.晾干装片，进行荧光显微镜观察。
三、银染法1.装片准备：将细胞或组织样本固定在载玻片上。
2.染色步骤：a.使用银染液进行初染，室温孵育5-10分钟。
b.用清水冲洗，去除多余染料。
c.使用显影液进行显影，约1-3分钟。
d.用清水冲洗，去除多余显影液。
e.使用定影液进行定影，约3-5分钟。
f.用清水冲洗，去除多余定影液。
g.晾干装片，进行显微镜观察。
四、甘油醛-苏丹黑染色（Golgi染色）1.装片准备：将细胞或组织样本固定在载玻片上。
2.染色步骤：a.使用甘油醛溶液进行初染，室温孵育5-10分钟。
b.用清水冲洗，去除多余染料。
c.使用苏丹黑溶液进行复染，室温孵育1-3分钟。
d.用清水冲洗，去除多余染料。
e.晾干装片，进行显微镜观察。
总结：以上为几种常见的装片染色方法，适用于不同类型的细胞和组织样本。
在实际操作过程中，可根据实验需求选择合适的染色方法。
详解蛋白质质谱鉴定技术原理和方法
详解蛋白质质谱鉴定技术原理和方法质谱分析技术有着高灵敏度，高精准度等特点，能够准确快速地鉴定蛋白质。
传统的质谱技术仅限于小分析物质的分析，随着新的离子化技术的出现和发展，如基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾电离质谱（ESI-MS）等，为准确快速鉴定蛋白质等大分子提供了便捷的条件。
目前，酶切蛋白质，液相色谱分离肽段，串联质谱分析多肽氨基酸序列，联合质谱数据分析已成为了鉴定蛋白质的首选方案。
本文主要讲下蛋白质谱鉴定的原理和应用。
一、MALDI-TOF基质辅助激光解吸附质谱技术（Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight, MALDI-TOF）的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。
MALDI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。
MALDI产生的离子常用飞行时间（TOF）检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足够，TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此MALDI-TOF 质谱很适合对蛋白质、多肽等生物大分子的研究。
MALDI-TOF-MS分析。
技术特点。
• MALDI-TOF 鉴定方便、快速，可以同时做上百个斑点。
• 主要用于纯蛋白或简单样本的鉴定，如2DE斑点。
• 成本较低。
样品要求。
• 蛋白质溶液：纯度> 90%；蛋白质总量> 5 ug，浓度> 0.1 ug/ul。
• 双向凝胶电泳点：考染、银染点清晰可见。
• SDS-PAGE胶条：单一蛋白质，考染、银染条带清晰可见。
二、ESI-MS电喷雾电离质谱（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。
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常用的蛋白质染色试剂分为已考马斯亮蓝为代表的有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。
其中考马斯亮蓝染色法的应用较为广泛，现将其与其他的蛋白质染色方法（主要是银染法）作一比较，帮助大家更好地去选择合适的蛋白质染色方法。
蛋白质的染色常用的有4类：有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。
其中有机试剂染色以考马斯亮蓝染色法（Coomasie brilliant blue，CBB）为代表，在蛋白质分析中常用，但对低丰度蛋白质的显现较差;银染灵敏度虽高，却常与质谱不兼容;荧光染色以SYPRO试剂为主，蛋白质检测灵敏度高，能兼容质谱，但由于需要配备特殊的检测仪器及试剂的昂贵，未被作为常规方法使用;而同位素显色则存在安全性和操作局限性等问题。
因此，筛选简便、节约、检测灵敏度高、质谱兼容的蛋白质着色法是蛋白质组研究所需。
由于考马斯亮蓝染色法的广泛运用，近年来就考马斯亮蓝染色法在提高其灵敏性方面研究者们作了许多改进，方法众多，评价不一。
我们在作双向凝胶电泳时，将常用的几种考马斯亮蓝染色法及银染进行了比较，并就其染色影响因素作出分析。
试剂固相pH梯度干胶条（IPG strip pH3-10NL，IPG strip pH5-8，17cm）、urea、CHAPS、TBP、DTT、Bio-Lyte 3/10 Ampholyte、IAM、SDS、Tris、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、CBB-G250均为BIO-RAD公司产品。
硫酸铵及磷酸均购自成都科龙试剂厂。
AgNO3为Sigma公司出品。
Protein molecular weight marker #SW0431为MBI公司出品。
甲醛、Na2S2O3与Na2CO3分别为成都天华科技股份有限公司、重庆北碚化学试剂厂和天津市塘沽鹏达化工厂产品。
仪器IPGphor等电聚焦仪、proTEANⅡ垂直电泳仪、Power PAC1000电泳仪、加样溶胀槽、GS-800 Calibrated Densitometer扫描仪、PDQuest凝胶图像分析软件均为BIO-RAD公司产品。
细胞总蛋白质的提取取4份经常规培养的急性早幼粒白血病细胞株（NB4）1×107细胞各重悬于350 μl蛋白质裂解缓冲液中（8mol/L Urea，2g/L CHAPS，2mmol/L TBP，2ml/L Carrier Ampholyte，痕量溴酚兰），置冰浴中超声裂解，静置30分钟，15500×g离心30分钟，取上清，进行蛋白质定量。
单向定量电泳取蛋白质分子量标准物，第一次按1∶2稀释后，以后按1∶3倍比例逐级稀释，经4级稀释后，取15μl上样液上样，β-半乳糖苷酶上样量依次分别为1μg、0.24μg、0.062μg、0.0156μg、0.004μg。
作12g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶单向电泳，同时电泳4份胶，显色以确定染色灵敏度。
双向电泳取300μl样品液沿水化盘中槽的边缘自左向右线性加入，将17cm IPG胶条胶面朝下置于槽中，静置45分钟后覆盖矿物油，在20℃溶胀11～16小时。
溶胀后的胶条置于等电聚焦盘中，在Protean IEF Cell中进行等电聚焦，温度设置为20℃，电压模式设置为：快速升压，250 V，0.5小时;500 V，0.5小时;10000 V，60000 Vh（伏特×小时）。
取IEF后的IPG 胶条，先后分别置于含DTT平衡液1（6mol/L urea，2g/L SDS，0.05mol/L Tris pH 8.8，200ml/L gylcecol，2g/L）及含碘乙酰胺平衡液2（同平衡液1，但其中DTT 换为2.5g/L 碘乙酰胺）中轻微摇荡各10分钟。
将平衡好的IPG 胶条置于预先灌制的12g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，封固，在15℃低温水循环条件下，15 mA/gel电泳15分钟，然后以25mA/gel恒流电泳。
显色取出SDS-聚丙烯酰胺凝胶，经超纯水清洗2次，每次1分钟，4块胶分别按4种不同的染色方法显色。
下列每步操作皆在摇床上进行。
4种染色法成份组成及操作如下：①传统考马斯亮蓝染色法：清洗后的凝胶经固定液（45.4%甲醇、4.6%乙酸）固定1小时，随后用染色液（45.4%甲醇、4.6%乙酸、0.1% CBB G250）着色过，再经洗脱液（5%甲醇、7.5%乙酸）过脱色至背景清晰。
②胶体考马斯亮蓝染色法（colloidal Coomassie brilliant blue，cCBB）染色法：凝胶先经超纯水漂洗后，再用colloidal Coomassie blue G250染色液（1.6%磷酸、8%硫酸铵、0.02% CBB G250、20%乙醇）着色过，洗脱液为超纯水，换液3～4次直至背景清晰。
③改良考马斯亮蓝染色法（modified Coomassie brilliant blue，mCBB）染色法[6];操作方法同胶体考马斯亮蓝染色法，只是染色液组成不同（0.12% CBB G250、10%硫酸铵、10%磷酸、20%乙醇），着色1小时即可。
④银染（silver staining）：凝胶漂洗后先被固定液（50%甲醇+ 5%乙酸）固定1小时，随后分别用50%甲醇和超纯水清洗各10分钟，0.02 mg/L Na2S2O3 致敏1分钟，超纯水清洗2次，每次1分钟，再用预冷的0.15% AgNO3着色20分钟，超纯水再次清洗2次，每次1分钟，2% Na2CO3 + 0.04% 甲醛显色20～30秒，当溶液变黄以后除去，换新鲜的溶液后继续显色直至显色适度后，以5%乙酸终止显色。
成像、分析、质谱鉴定脱色后，凝胶经GS-800 Calibrated Densitometer扫描成像，用PDQuest软件进行分析。
切取蛋白质点，胰酶消化，行质谱鉴定。
结果4种染色法的蛋白质检测灵敏性分析β-半乳糖苷酶的上样量依次分别为1、0.24、0.062、0.0156和0.004μg。
经传统考马斯亮蓝染色后的条带在62ng水平隐隐可见;而胶体考马斯亮蓝染色法的灵敏度稍高，62ng条带明显可见;改良考马斯亮蓝染色法的效果更好些，在15.6ng水平可见条带的显示;而银染法灵敏度最高，在15.6ng水平可见清晰条带的显现，同时在4ng可见隐约条带。
4种染色法的比较显示，灵敏度最高的是银染法，可达纳克级水平，其次为改良考马斯亮蓝染色法，10纳克级蛋白质能被检测。
而胶体考马斯亮蓝染色法和经典考马斯亮蓝染色法稍差，检测水平仅达几十纳克。
4种染色法的双向电泳蛋白质点显示比较来自NB4细胞的全蛋白经pH 3-10NL的等电点梯度分离，SDS-PAGE 二维垂直电泳后被3种考染法着色成像的显示可以看出传统考马斯亮蓝染色法的蛋白质点显现最少，胶体考马斯亮蓝染色法的蛋白质点显现较多，而改良考马斯亮蓝染色法的蛋白质点显现更多。
凝胶背景以后二者为更清晰。
经PDQuest软件进行分析，3幅图的蛋白质点显现数分别为483、679、890。
NB4细胞的全蛋白经pH 5-8 IPG分离，分别经改良考马斯亮蓝染色法与银染法着色成像的蛋白点显示，二者上样量一致，蛋白点的显现数量相当，但银染的蛋白点明显显示着色重。
这与单向电泳的效果相同。
4种染色法的可操作性比较在比较其蛋白质检测灵敏性的同时，对染色法的操作简便性、安全性以及蛋白质经质谱鉴定的成功率也作了对比。
比较显示，考马斯亮蓝染方法简便，但耗时较长，经改进后可以做到无毒操作，质谱兼容性较高。
银染步骤繁多，但耗时短;操作过程中有甲醇、甲醛等毒性物的接触，质谱兼容性低。
即使我们选择的银染法被文献报道为质谱兼容的，但仍然表现为低的蛋白鉴定率，不及考马斯亮蓝染。
讨论凝胶染色方法对蛋白质分辨率的影响提高双向凝胶电泳的分辨率是蛋白质组学研究尚待解决的课题及技术发展方向，影响蛋白质分辨率的因素较多，其中凝胶染色方法对蛋白质分辨率的影响不可忽视，它影响了实验的显像结果，直接干预了后续的质谱鉴定。
目前，在蛋白质组学领域中广泛应用的是考马斯亮蓝染色法和银染法两种。
考马斯亮蓝（Coomassie brilliant blue，CBB G-250）的化学名称为二甲花青亮蓝，偏酸性，与蛋白质的碱性基团结合，颜色由棕黄色转为深兰色。
考马斯亮蓝染色法可以达到微克级检测水平，着色程度与蛋白量的线性动力学相关范围广，适合定量分析。
该法由于较低的成本、使用方便及与下游的质谱鉴定技术的良好相容性，而得到了非常广泛的使用。
然而微克级的检测水平使它漏检了相当多的低丰度蛋白质，日益成为蛋白质组学的瓶颈，因此大量提高染色灵敏度的研究及各种染色液的配方和方法应运而生，经文献报道的方法众多，评价不一。
我们的试验选择了3种常用的考马斯亮蓝染色法进行比较，测得传统考马斯亮蓝染色法的灵敏度可达几百纳克，胶体考马斯亮蓝染色法能检测到几十纳克蛋白，改良考马斯亮蓝染色法则可达几纳克蛋白水平。
考马斯亮蓝染色法经过改进能获得高的蛋白质检测灵敏度，甚至可与银染媲美。
银染法是利用银离子与氨基酸共价结合，还原剂的加入使与胶内蛋白质结合的银离子形成金属银而显色。
文献报道检测限度可低于1 ng的蛋白质，其灵敏度比传统考马斯亮蓝染色法高约100倍，被广泛应用于蛋白质组学研究，但银染步骤复杂，繁琐，且着色线性动力学的覆盖范围窄，导致蛋白质差异显示的不准确性，同时由于游离银离子及相关试剂的存在，给后续分析及鉴定带来一定的实际困难。
我们的实验只采用了一种银染法，结果显示银染法的灵敏性高于所有考马斯亮蓝染色法，4 ng的蛋白质条带也能显现，但蛋白质鉴定成功率低。
蛋白质检测灵敏度的影响因素蛋白质着色显示的灵敏性既取决于染色试剂，如上述分析，又与染色过程中涉及的有机溶剂及离子有关。
在考马斯亮蓝染色法和银染法中都存在如甲醇、乙醇、乙酸、甲醛等有机溶剂的使用。
甲醇和乙醇在染色里起固定作用，把蛋白质固定在凝胶中或阻滞它们在凝胶中扩散。
同时也去除电泳过程中遗留的干扰染色过程的物质，如去垢剂、还原剂和缓冲液等成分。
乙酸的作用既是辅助固定蛋白质同时又维持染液的酸性度，以利于考马斯亮蓝与蛋白质结合。
他们的存在有利于获得背景清晰、信噪比高的图像。
由于3种有机溶剂的相似作用，我们在胶体考马斯亮蓝染色法及改良考马斯亮蓝染色法里，保留乙醇作为唯一的固定清洁剂，用磷酸替代乙酸发挥酸化作用，结果显示两种考马斯亮蓝染色法获得的图像背景比传统考马斯亮蓝染色法的要清晰，条带也锐利。
在胶体考马斯亮蓝染色法中，酸性的乙醇介质中加入硫酸铵，使得着色剂形成胶体染色颗粒，胶本身可不被显著着色，蛋白染色灵敏度得以提高。
而在改良考马斯亮蓝染色法中，在高酸、高离子环境下，蛋白质的葡糖胺和天冬酰胺酸质子化，更利于与染色剂发生结合。