血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定—综合实验

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实验三血清γ-球蛋白的分离、纯化及鉴定七年制

氨基酸序列分析通过质谱分析，对血清γ-球蛋白的部分氨基酸序列进行了测定，为后续
的结构分析提供了基础。
序列和结构分析结果解读
根据氨基酸序列，对血清γ-球蛋白的一级结构进行了深入分析，确定了其基本组成。
利用计算机模拟技术，对血清γ-球蛋白的高级结构进行了预测，揭示了其可能的折叠方式和空间构象。
一级结构分析高级结构预测
实验态度培养
实验过程中需严谨细致，实事求是记录数据，培养了我们的科学态度和实验精神。
团队合作意识
实验操作需要小组成员密切配合，增强了我们的团队协作意识和沟通能力。
实验不足与改进
在实验过程中，我们也发现了一些不足之处，如样品处理过程中可能存在的误差、层析柱的平衡问题等，需要在今后的实验中加以改进和完善。
结果讨论与展望
实验意义
输标02入题
本实验成功分离、纯化了血清γ-球蛋白，为进一步研究其功能和作用机制提供了材料。
01
未来可以深入研究血清γ-球蛋白与其他蛋白质的相互作用，以及其在生理和病理过程中的作用，以期为相
关疾病的诊断和治疗提供新思路。
04
03
未来研究方向
05
结论
实验总结
实验原理
本实验基于蛋白质分离纯化的基本原理，通过离子交换层析和凝胶过滤层析技术，实现了血清γ-球蛋白的分离和纯化。
03
通过比较肽段的序列信息与数据库中的蛋白质序列，可以鉴定出蛋白质的身份。
序列分析和结构预测的方法
01
序列分析通过测定蛋白质中每个氨基酸的排列顺序，确定蛋白质的一级结构。
02
结构预测则基于已知的氨基酸序列，利用计算机模拟技术预测
蛋白质的三维结构。
这些方法对于理解蛋白质的功能和作用机制具有重要意义。

【生物化学实验】血清γ球蛋白分离纯化与鉴定PPT课件

欲去除盐析法分离得到的球蛋白粗提液中大量盐，通常有两种方法：
凝胶层析法
透析
本试验采用葡聚糖凝胶——Sephadex G 25层析方法除去球蛋白粗提液中的盐硫酸铵，以便下一步用离子交换层析方法进一步提纯球蛋白。
9
凝胶柱层析脱盐
10
目的与要求
1.学习了解凝胶层析的原理
2.熟练了解凝胶层析的用途
/min，使凝胶均匀沉降，不断补充，直至15cm。 4、上留1—2mm的水，关闭出口。注意：★ 床面上要保持少许水，防止胶床露出液面。
★ 胶面不平，用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降，使表面平整。
16
▲ 加样与洗脱
1、加样：用滴管将盐析后样品加入柱床面，打开出口使样品溶液渗入凝胶。
2、洗脱：加入洗脱液，打开出口，保持流速10滴/min，收集洗脱液，用钠氏试剂检测胺。
3、保存：检测洗脱液的蛋白质量，保存含量高的进一步纯化
▲ 凝胶的再生
不断加洗脱液，使铵全部流出，为下次实验做准备。
17
注意事项：
1 . 凝胶柱的制备质量决定分离效果的好坏。 2. 加样分离时，滴速越慢，分离效果越好。
★ 以管号为横轴，蛋白质含量为纵轴绘制洗脱曲线，分析实验结果。
18
三、DEAE－纤维素离子交换层析
11
凝胶层析原理：
凝胶层析法是按混合物各组分分子量大小不同随流动相经过层析柱的时间不同而被分离的技术。
凝胶是一类具有三维多孔网状结构的干燥颗粒，当吸收一定量溶液后溶涨成柔软、富有弹性、不带电荷、不与溶质相互作用的惰性物质，凝胶层析以其为固定相。层析时，直径大于凝胶网孔的大分子物质不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的间隙随流动相向下移动，所以流程短、流速快，首先流出层析柱；而小分子物质直径小于凝胶网孔能自由出入，洗脱时间长，后流出层析柱，经过一定时间层析，分子大小不同的物质彼此分开，达到分离的目的。

血清γ-球蛋白的分离-夏洪

+
+
+
Pr
+ +
+
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+
+ +
Pr
+ +
中性盐破坏了这两个稳定性因素，使蛋白质沉淀。
中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
聚糖凝胶混匀，倾入层析柱内，静止后分层，凝胶高度要在柱高的 1/3~3/4之间。当液面接近凝胶上表面时将出口胶管夹紧待用。
注意：装柱要均匀，不要有气泡和分层，凝胶面要平整
（2）加样：
向装有γ-球蛋白的离心管内加入PBS 10滴，用玻璃棒搅拌使之溶解。再用乳头吸管吸出γ-球蛋白液，加到层析柱内凝胶表面。待γ-球蛋白液全部进入凝胶柱内时，再用乳头吸管小心加入PBS约1cm高，待大部分液体进入凝胶柱后，再继续加PBS直至洗脱完毕（加液时注意不要冲击凝胶表面）。在整个洗脱过程中不能让液面降至凝胶面以下。
血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定
指导教师：夏洪李晓梅
本次实验内容
• （一）血清γ-球蛋白的分离与纯化 • （二）血清γ-蛋白的鉴定 —— 醋酸纤维素薄膜电泳
实验17
（一）血清γ-球蛋白的分离与纯化
【实验目的】
1．掌握蛋白质分离纯化的主要方法
和原理； 2．熟悉盐析和层析的基本操作；
浓缩（Anti-dialysis）浓缩将凝胶过滤得到的γ－球蛋白液倒
入透析袋内，悬于盛有浓蔗糖溶液的小烧杯内，振荡1小时以上，观察袋内液体体积变化

实验三血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定

实验三血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定【实验目的】一.掌握层析技术的基本原理及应用二.了解层析技术的分类三.掌握凝胶层析和离子交换层析的原理【实验原理】一、层析技术1.层析法层析法也称色谱法，是一种广泛运用的物质分离纯化、分析鉴定技术,是1903年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。

将植物色素溶液通过装有CaCO3 吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。

2.依据混合物中各组分理化性质的差异—分子大小、酸碱性、吸附力、分子形状、分子极性、分子亲和力以及分配系数等。

3.基本原理固定相—固定不动。

流动相—对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。

分离原理：待分离混合物中各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、再吸附、再解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。

4．凝胶层析(凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析)①定义：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。

②基本原理：固定相：凝胶，不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒内部都具有很多细微的小孔，如同筛子一样，故称分子筛。

包括琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖-葡聚糖复合凝胶。

流动相：洗脱液。

样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，小分子能进入凝胶孔内部，做不定性扩散运动，流程长，速度慢，后流出；大分子不能进入凝胶孔内部，只能在颗粒间移动，作垂直向下运动，流程短，先流出→大小分子彼此分开。

③影响因素*层析柱的选择及装填：柱大小—分离样品量凝胶型号—分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。

凝胶分离范围之外的分子，难以分离。

如大小不同的两种全排阻分子/完全渗透分子。

*洗脱液：溶解待分离物质，不变性*加样量：1%～5%*凝胶的再生5. 离子交换层析离子交换层析是利用离子交换剂对各种离子的亲和力不同，借以分离混合物中各种离子的一种层析技术。

血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定综合性实验的创新与实践

血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定综合性实验的创新与实践摘要】为改革生物化学实验，提高实验教学水平，对“血清γ-球蛋白的分离与提纯”实验进行改进和重新整合，建立了综合性实验“血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定”，实现实验内容和生化技术的综合与创新。

经过4年的医学本科生教学实践，实验方法稳定，结果重复可靠，适合实验教学，有利于提高大学生的综合实验技能。

【关键词】γ-球蛋白综合性实验创新血清γ-球蛋白又称免疫球蛋白（Ig），具有重要的医药应用价值。

许多医学院校把提取血清γ-球蛋白作为生化实验教学内容。

本室于2007年初，对原有生化实验“血清γ-球蛋白的分离与提纯”进行了改进和大胆的创新，选用猪血清，保留原有的硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶除盐的操作步骤，增加了分光光度法测定蛋白含量、醋酸纤维素膜及SDS-PAGE法鉴定提取的血清γ-球蛋白纯度，建立并开设了16学时的综合性实验“血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定”。

通过血清γ-球蛋白的分离、纯化、鉴定、蛋白测定及进一步鉴定的五个子实验，涵盖了生化的离心、层析、分光光度和电泳法四大传统技术。

突破了旧的单纯验证理论或简单孤立的学习一种实验方法或一个知识点的教学模式，使学生受到一次综合性生化技能训练，提高了实验教学效率和效果。

1 材料与方法1.1 仪器材料1.1.1 仪器 KDC-40低速离心机、1.5cm×20cm玻璃层析柱、722-可见分光光度计、DYY-2C电泳仪及DYCZ-24D型垂直板电泳槽。

1.1.2 试剂材料新鲜猪血清、pH7.0饱和硫酸铵溶液、0.01mol/L pH7.0 PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）、葡聚糖凝胶G—25（SephadexG-25）、奈氏（Nessler）试剂、20%（W/V）磺基水杨酸溶液、pH8.6离子强度0.06巴比妥缓冲液、氨基黑10B、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、BSA（牛血清白蛋白）等，除SephadexG-25外均为国产。

07 生物化学实验--血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定

血清γ- 球蛋白的分离、纯化与鉴定【目的】1 ．掌握盐析 - 层析法提纯血清γ- 球蛋白的原理和技术。

2 ．熟悉电泳比较法定性γ- 球蛋白的方法。

3 ．了解扫描定量γ- 球蛋白的方法。

【原理】蛋白质的分离、纯化是研究蛋白质化学性质及生物学功能的重要手段。

根据不同蛋白质的分子量、溶解度以及在一定条件下带电荷性状的差异来分离、纯化各种蛋白质。

1 ．γ- 球蛋白的分离、纯化（ 1 ）盐析：清蛋白与球蛋白的稳定性不同，故可用盐析法对血清蛋白质初步分离。

在半饱和硫酸铵溶液中，清蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心所得的沉淀即是球蛋白混合物。

（ 2 ）脱盐：球蛋白混合物中的硫酸铵会妨碍进一步分离纯化，应除去。

脱盐的方法有多种，本试验采用凝胶过滤。

在凝胶过滤中，柱中的填充料是高度水化的惰性多聚物，最常用的有葡聚糖凝胶（ Sephadex Gel ）和琼脂糖凝胶 (Agarose Gel) 等颗粒。

葡聚糖凝胶是具有不同交联度的网状结构物，它的“ 网眼” 大小可以通过交联剂与葡聚糖的配比来达到。

不同型号的葡聚糖凝胶可用来分离和纯化不同分子大小的物质。

把葡聚糖凝胶装在层析柱中，不同分子大小的蛋白质混合液借助重力通过层析柱时，比“ 网眼” 大的蛋白质分子不能进入网格中，而被排阻在凝胶颗粒之外，随着洗脱剂在凝胶颗粒的外围而流出。

比‘ 网眼 ' 小的分子则进入凝胶颗粒内部。

这样，由于不同大小的分子所经路程距离不同而得到分离。

大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。

所以含硫酸铵的蛋白值溶液通过层析柱时，先被洗脱出层析柱的是球蛋白，小分子硫酸铵由此法分离除去（参见第 2 篇第 2 章图 2-3 ）。

（ 3 ）纯化：γ- 球蛋白与α 、β- 球蛋白（以及微量的清蛋白），等电点不同，所以采用离子交换层析，从球蛋白混合物中分离、提纯出γ- 球蛋白。

用于蛋白质分离的层析材料多是离子交换纤维素，它们的优点是对蛋白质的交换容量较一般的离子交换树脂大，而且品种较多，可以适用于各种分离目的。

11.6 生化实验报告血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定及电泳分析

血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定及电泳分析【实验目的】1、了解蛋白质分离提纯的总体思路。

2、掌握盐析法、凝胶层析法和离子交换层析的实验原理及操作技术3、掌握电泳法分离纯化蛋白质的方法。

【实验原理】1、蛋白质的粗提——盐析法胶体的盐析是加盐，盐中的带电粒子使蛋白质周围的水化膜减弱，胶粒溶解度降低，形成沉淀析出的过程，是胶体的聚沉现象的一种。

向蛋白质溶液中加入某些浓的无机盐[如(NH4)2SO4或Na2SO4]溶液后，可以使蛋白质凝聚而从溶液中析出，这种作用就叫做盐析。

盐析不能使蛋白质变性，可以复原。

利用这个性质，可以采用多次盐析的方法来分离、提纯蛋白质。

蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。

蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。

同时，离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，蛋白质溶解度更加降低，之蛋白质分子之间聚集而沉淀。

由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，从而使之从其他蛋白中分离出来。

简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。

由于清蛋白的亲水性比球蛋白大，且清蛋白的分子比球蛋白小，所以清蛋白需要高浓度的盐溶液才能够发生盐析，低浓度的时候球蛋白发生盐析。

盐析法分离蛋白质：各种蛋白质的颗粒大小、亲水程度、pI不同，盐析所需的盐浓度也不一样。

调节盐浓度可使不同的蛋白质沉淀，从而达到分离的目的。

常用中性盐：硫酸铵、硫酸钠等。

硫酸铵：温度系数小，溶解度大，蛋白谱广，盐析效果好，不易引起变性。

可用硫酸/氨水按需要调节pH值。

本实验中清蛋白分子小，亲水性强，在饱和硫酸铵溶液中可沉淀析出，而球蛋白分子大，亲水性弱，在半饱和硫酸铵溶液中即可沉淀析出。

血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定

实训二血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定目的要求1．了解蛋白质分离提纯的总体思路。

2．掌握盐析法、分子筛层析法、离子交换层析等实验原理及操作技术。

实验原理血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白含量约占16％，100ml血清中约含1.2g左右。

首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中(常用硫酸铵)溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析法。

半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离,沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。

用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此首先必须去除。

常用的方法有透析法、凝胶层析法等。

本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。

当溶液通过SephadexG--25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中．因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。

脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可进行分离。

α－球蛋白、β-球蛋白的PI<6.0；γ－球蛋白的PI为7.2左右。

因此在PH6.3的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同。

经DEAE(二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析时，带负电荷的α－球蛋白和β-球蛋白能与DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合；带正电荷的γ－球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。

因此随洗脱液流出的只有γ－球蛋白，从而使γ－球蛋白粗制品被纯化。

其反应式如下：用上述方法分离得到γ－球蛋白是否纯净，单一？可将纯化前后的γ－球蛋白进行电泳比较而鉴定之。

试剂和器材1．试剂（1）饱和硫酸铵溶液：称固体硫酸铵(分析纯)850g，置于1000ml蒸馏水中，在70一80℃水温中搅拌溶解。

将酸度调节至pH7.2，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。

实验六血清γ-球蛋白的分离、纯化及鉴定

1、小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上缓冲液面刚好下降到凝胶床表面(注意不要使液面低于凝胶床表面以致空气进行凝胶床)。 2、关紧下端出口，用滴管吸取盐析球蛋白液，小心缓慢的加到凝胶床表面上(注意不要将凝胶粒中冲起或破坏凝胶床表面的平整)。

3、开下端出口，使样品进入凝胶床，关闭出口，小心加入适量pH6.3 4、放开，流速约20滴/分钟，立即检测（方法见后），检测到蛋白后收集三管， 20滴/管。颜色最深而且无浑浊的管用于下一步操作。
血清γ－球蛋白的分离、纯化及鉴定
分工合作

专人、固定锥形瓶，放开，不断滴加pH6.3 醋酸盐缓冲液，防止气泡。盐析混匀时需要两个人合作。两次操作是一样的，都有动手的机会。改错！（P46页错误）
操作
一、盐析 <1>取1ml血清1ml， <2>取1ml饱和(NH４)２SO４溶液缓慢滴入，边加边摇。 <3>混匀后于室温中放置10分钟。
洗脱液中蛋白质的检查

取小试管3个，分别加20％磺基水杨酸10滴，从下端管口取1滴，滴于试管中，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出。对比法：与未加液体的管对比，出现浑浊

三、阴离子交换层析

经处理再生后的DEAE－纤维素，将脱盐后含球蛋白的溶液加于DEAE纤维阴离子交换柱上，用同一缓冲液洗脱，分管收集洗脱液。检测到蛋白后立即收集三管，20滴/管，编号。
操作
一、盐析 <1>取1ml血清1ml， <2>取1ml饱和(NH４)２SO４溶液缓慢滴入，边加边摇。 <3>混匀后于室温中放置10分钟。

<4>然后每分3500转离心10分钟，并小心吸去上清液，用滤纸条吸除上清夜。 <5>沉淀加pH6.5醋酸氨缓冲液0.5ml，使之溶解，作为纯化γ球蛋白用。

血清清蛋白、γ-球蛋白分离、纯化与纯度鉴定

血清清蛋白、γ-球蛋白分离、纯化与纯度鉴定一、实验目的1.掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法2.掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法3.掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法4.掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法5.学习柱层析技术二、实验原理蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。

不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。

利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。

（一）粗提原理-盐析法1.盐析法：在蛋白质溶液中,加入无机盐至一定浓度，或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。

2.水化膜减弱、消失。

蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。

3.蛋白质表面的电荷大量被中和。

中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。

4.由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。

（二）脱盐原理-凝胶层析1.盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须先脱盐后才能进一步纯化。

2.凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质分子大小的不同而将其分离的技术。

（三）纯化原理-离子交换层析离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。

（四）纯度鉴定-醋酸纤维素薄膜电泳血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。

它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。

由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。

因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。

三、材料与方法：（一）实验材料1.样品：人混合血清2.试剂：葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)层析柱、二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素离子交换层析柱、各不同浓度的pH6.5醋酸铵缓冲溶液、pH8.6巴比妥缓冲溶液、氨基黑10B染色液、20%磺基水杨酸溶液、饱和硫酸铵溶液、1%BaCl2溶液、漂洗液器材：层析柱、电泳仪、电泳槽、离心机、离心管、黑色反应板等（二）实验方法1.实验步骤2.注意事项✓上样时，滴管应沿柱上端内壁加入样品，动作应轻、慢，勿将柱床冲起。

血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定-lhy-图文

1）
饱和(NH4)2SO4 1ml
弃上清
取1ml血清
静置5min
作1ml标记线
3500r/min 5min
边加边摇！
加PBS溶解沉淀至1ml
2）
饱和(NH4)2SO4 0.5ml
静置5min
弃上清
3500r/min 5min 边加边摇！
加PBS 0.5ml溶解沉淀
2.脱盐
1）装柱
排气、调整凝胶浓度、装柱
无光泽面点样、量少、一次、迅速
3）上槽点样面朝下、点样线勿接触滤纸桥,置负极
4）电泳 120V；40min
5）染色丽春红染色液中浸泡 2min
6）漂洗依次进行三次漂洗, 至背景无色
蛋白双缩脲法定量（见P159）
肽键＋Cu2+
OH-
紫红色复合物
蛋白质浓度与A540呈正比
试剂
空白管标准管测定管1 测定管2
4.64
5.06
5.06
5.12
6.85~7.5
分子量（ 6~9
5~20
30
×104）
含量（% 60~70 2~3.5
4~7
）
电泳缓冲液: pH=8.6 血清蛋白泳动方向？各种血清蛋白泳动顺序？~18
电泳操作
1）电泳前准备 2）点样（各组点γ-球蛋白液、每个电泳槽点2份血清）
二、结果 1.脱盐检测结果
1）纳氏试剂、双缩脲试剂颜色反应结果（半定量） 2）收集哪些洗脱液用于鉴定
2.电泳鉴定结果
绘出血清和γ-球蛋白液电泳结果
3.双缩脲法定量鉴定结果
计算γ-球蛋白液浓度
三、讨论根据结果评价分离效果, 分析原因
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳

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血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定
【实验目的】
1．学习了解凝胶层析和离子交换层析分离纯化蛋白质的基本原理及应用
2．掌握醋酸纤维薄膜电泳技术的原理及应用
蛋白质分离纯化与鉴定
【基本原理】
蛋白质的分离、纯化及鉴定是研究蛋白质化学性质及生物学功能的重要手段之一。
分离纯化蛋白质的方法是利用不同蛋白质的某些物理、化学性质的不同而建立的方法，其中有盐析、离子交换、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳、离心等。在分离纯化时，根据情况选用几种方法，相互配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。
【实验目的】
1. 通过使用DEAE－纤维素离子交换层析法，进一步纯化γ-球蛋白脱盐液，得到较纯的γ-球蛋白溶液
2. 学习了解离子交换层析方法的基本原理和应用范围
离子交换层析的基本原理
离子交换层析是一种常用的、通过使用各种类型的离子交换剂达到分离纯化目的的层析方法。离子交换剂是通过化学反应将带电基团引入到惰性支持物上形成的固体物质，在实验中作为固定相。如果其带负电，则能结合阳离子，成为阳离子交换剂；如果其带正电，则能结合阴离子，称为阴离子交换剂。可根据实验需要，选择不同的离子交换剂进行离子交换层析。
血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定
【实验原理】本实验采用硫酸铵盐析、葡聚糖凝
胶过滤、离子交换层析方法，分离纯化血清γ-球蛋白。最后用醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定γ-球蛋白的纯度。
一、盐析法粗分离血清γ-球蛋白
原理
盐析法是根据不同蛋白质在一定浓度的盐溶液中溶解度度不同，从而分别析出，达到彼此分离的分离方法。
凝胶层析原理：
凝胶层析法是按混合物各组分分子量大小不同随流动相经过层析柱的时间不同而被分离的技术。
凝胶是一类具有三维多孔网状结构的干燥颗粒，当吸收一定量溶液后溶涨成柔软、富有弹性、不带电荷、不与溶质相互作用的惰性物质，凝胶层析以其为固定相。层析时，直径大于凝胶网孔的大分子物质不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的间隙随流动相向下移动，所以流程短、流速快，首先流出层析柱；而小分子物质直径小于凝胶网孔能自由出入，洗脱时间长，后流出层析柱，经过一定时间层析，分子大小不同的物质彼此分开，达到分离的目的。
凝胶层析法原理
凝胶层析法又叫凝胶过滤。基本原理是用一般的柱层析方法使分子量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相从而使物质分离。它利用一些多孔的细珠支持物，这些小孔大小不一，可以允许半径在一定范围内的分子透过它。把经过充分溶胀的凝胶装入层析柱中，加入样品后，由于凝胶的三维空间网状结构，分子量小的物质能进入凝胶，流程长，移动速度慢。分子量大的物质则被排阻在交联网状物之外，沿着凝胶颗粒间的孔隙随溶剂流动，其流程短，移动速度快，先流出层析床。经过分部收集流出液，分子量不同的物质便互相分离。
3、保存：检测洗脱液的蛋白质量，保存含量高的进一步纯化
▲ 凝胶的再生
不断加洗脱液，使铵全部流出，为下次实验做准备。
注意事项：
1 . 凝胶柱的制备质量决定分离效果的好坏。 2. 加样分离时，滴速越慢，分离效果越好。
★ 以管号为横轴，蛋白质含量为纵轴绘制洗脱曲线，分析实验结果。
三、DEAE－纤维素离子交换层析
/min，使凝胶均匀沉降，不断补充，直至15cm。 4、上留1—2mm的水，关闭出口。注意：★ 床面上要保持少许水，防止胶床露出液面。
★ 胶面不平，用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降，使表面平整。
▲ 加样与洗脱
1、加样：用滴管将盐析后样品加入柱床面，打开出口使样品溶液渗入凝胶。
2、洗脱：加入洗脱液，打开出口，保持流速10滴/min，收集洗脱液，用钠氏试剂检测胺。
DEAE （二乙基氨基乙基）－纤维素含有可离子化的碱基，可与氢离子结合，成为带正电荷的阴离子交换剂。
离子交换层析的基本原理
靠静电引力结合在交换剂上的离子，叫做平衡离子
应用离子交换层析时要找到适当的条件，使一些化合物带电结合到交换剂上，而使另一些化合物不结合到交换剂上。在本实验条件下， DEAE－纤维素是具有带多个正电荷游离碱基的聚合物，所以主要靠静电吸引与带负电的蛋白质形成离子键，对蛋白质提纯有很大好处
生物化学实验 CQMU
生物化学综合实验血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定
P、180 重庆医科大学基础医学实验教学中心
生物化学与分子生物学实验室 2008年10月
实验目的从人血清中分离纯化γ-球蛋白
实验方法
一、盐析法粗分γ-球蛋白二、凝胶过滤方法脱盐三、离子交换层析方法纯化γ-球蛋白四、醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定γ-球蛋白的纯度本实验综合多种实验技术和方法，共同完成一个实验目标，所以属于综合性实验。
葡聚糖凝胶（Sephadex)
应用最多的凝胶！
交联度网状结构网孔径吸水量机械强度耐压力
大致密小
小
大高小疏松大大 Nhomakorabea小
低
操作步骤：
▲ Sephadex G-50的准备
▲ 装柱（15~20cm）
1、层析柱保持垂直。 2、放蒸馏水，排沙芯下空气，关闭出口。 3、加入搅拌均匀的SephadexG-50悬液，调节流速10滴
本实验在半饱和硫酸铵溶液中，清蛋白溶解，球蛋白将沉淀析出，经离心所得的沉淀即为球蛋白的粗提液。
盐析法分离血清球蛋白
硫酸铵是蛋白质盐析常用的中性盐，在 0～30℃范围内溶解度变化不大；25℃时饱和溶解度为4.1 mol/l，0℃时饱和溶解度为 3.9 mol/l。在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以析出来。而且硫酸铵价廉易得，分段盐析效果好，不容易引起蛋白质变性。
欲去除盐析法分离得到的球蛋白粗提液中大量盐，通常有两种方法：
凝胶层析法透析本试验采用葡聚糖凝胶——Sephadex G 25层析方法除去球蛋白粗提液中的盐硫酸铵，以便下一步用离子交换层析方法进一步提纯球蛋白。
凝胶柱层析脱盐
目的与要求
1.学习了解凝胶层析的原理
2.熟练了解凝胶层析的用途
具体操作
硫酸铵分段盐析：血清1.0 ml，一边摇一边缓慢加入饱和硫酸铵1.0 ml，混匀后室温下静置10分钟，3000 rpm离心10分钟。用滴管仔细地吸出上清，弃去。沉淀加0.02 mol/l pH 6.5 磷酸缓冲液4.0 ml溶解，此为球蛋白粗提液，留作进一步纯化。
二、葡聚糖凝胶柱层析脱盐