中药制剂分析整理之HPLC法

HPLC法

掌握HPLC法实验条件的选择

掌握HPLC法的定量分析方法

⏹特点

1.适用范围广（可分析80%有机化合物）

2.分离性能好

3.分析速度快

4.灵敏度高

5.色谱柱可反复使用

6.流出组分容易收集

⏹HPLC实验条件的选择

1. HPLC前处理

2. 色谱柱的选择

3. 流动相的选择

4. 洗脱方式的选择

5. 检测器的选择

HPLC前处理

1.流动相的处理

溶剂的纯化

流动相脱气：除去流动相中的空气

方法：超声波振荡脱气、惰性气体鼓泡吹扫脱气、抽真空、加

热脱气、在线脱气系统

过滤除去固体微粒；常用的滤头：亲水、亲脂、两用；0.45µm

色谱纯试剂

重蒸水

2.样品的处理

⏹除去杂质、纯化样品

⏹浓缩样品或进行衍生化

⏹过滤/高速离心

色谱柱的选择

根据被分离物质的化学结构、极性和溶解度

用途：制备型、分析型

⏹色谱柱的分类

⏹正相色谱柱：固定相极性大于流动相，一般指硅胶柱，以正己烷系列为流

动相。正相色谱法

⏹主要用于分离分析能溶于有机溶剂的极性及中等极性分子型物质

⏹反相色谱柱：固定相极性小于流动相，其技术就是在硅胶基质上键合有机

碳链。

一般指C18、C8、苯基柱等，以甲醇、乙腈、水为流动相。反相色谱法

⏹适用于非极性及中等极性化合物

⏹目前用的最多的色谱柱是反相键合相色谱柱

最常用：（octadecylsilane) ODS柱/C18 （十八烷基键合相）

⏹键合相的优点

①使用过程不流失

②化学性能稳定，在PH2-8的溶液中不变质

③热稳定性好，一般在70℃以下稳定

④载样量比硅胶约大一个数量级

⑤适于作梯度洗脱

流动相的选择

⏹对流动相的基本要求

①不与固定相发生化学反应

②对样品有适宜的溶解度

要求容量因子k在2～5 (最佳) 或1～10 (可用)

k值太小，不利于分离；k值太大，可能使样品在流动相中沉淀

③必须与检测器相适应

例如用紫外检测器时避免末端吸收

④粘度小

（容量因子(capacity factory):也称为分配容量（partition volume）、

容量比（capacity ratio），是在达到分配平衡后，组分在固定相

中的量与流动相中的量之比。也称为质量分配系数。）

流动相的选择

反相键合相色谱

正相键合相色谱

反相离子对色谱

键合相色谱法：化学键合相为固定相的色谱法，分离机制以分配作用为主，对不封尾的键合相还有一定的吸附作用。应用最广泛的色谱法

⏹反相键合相色谱流动相的选择

1.部分含水溶剂：水为基础溶剂，再加入可与水互溶的有机极性调节剂（如甲醇、乙腈、四氢呋喃）

适用于分离中等极性、弱极性药物

常用甲醇－水、乙腈－水系统

有机极性调节剂的性质及其与水的比例对保留值和分离选择性有影响

2.缓冲溶液

常用的缓冲液：三乙胺磷酸盐、磷酸盐、醋酸盐溶液。

适用于可溶于水并具可解离特性的化合物，如蛋白质及弱酸、弱碱类化合物。

缓冲液及PH不同、及所占比例不同会影响组分的保留值

注意

由于C18链在水相环境中不易保持伸缩状态，故对于C18为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5％，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定

3.非水溶剂

流动相为不含水系统。

用于分离疏水性物质。

在乙腈及甲醇中加入二氯甲烷或四氢呋喃。这种色谱法称为非水反相色谱法。

⏹正相键合相色谱流动相的选择

流动相采用饱和烷烃（如正己烷）中加入极性较大的溶剂为极性调节剂（如异丙醚），通过调节极性调节剂的浓度来改变溶剂强度。

⏹反相离子对色谱流动相的选择

是极性较强的水系统混合溶剂

最常用的是甲醇－水、乙腈－水中加入0.003-0.01mol/L的离子对试剂 离子对试剂的性质、浓度、流动相的PH及流动相中有机溶剂的性质和比例都会影响组分的保留值和分离效果

洗脱方式的选择

等度洗脱

在一个分析周期内流动相的组成保持恒定

适合于组分数目较少、性质差别不大的样品

梯度洗脱

在一个分析周期中，程序控制流动相的组成改变（如溶剂的极性、离子强度、pH值等），使每个组分都在适宜的条件下获得分离。

适合于组分数目较多、组分间k值相差较大（10-100倍）的复杂混合物

⏹梯度洗脱的特点

优点

缩短分析时间，提高分离度，改善峰形。使峰变尖锐，使微量组分容易被检出，提高检测灵敏度

缺点

常常会引起基线漂移，重现性较等度洗脱差

⏹梯度洗脱需注意内容

1.要注意溶剂的互溶性，不相混容的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相

2.所用的溶剂纯度要求更高，以保证好的重现性

3.混合溶剂的粘度常随组成而变化

4.每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。需让10-30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡

检测器的选择

1.紫外检测器（ultraviolet detector;UV)

2.荧光检测器（fluorophtometric detector;FD)

3.蒸发光散射检测器（evaporative light scattering detector; ELSD)

4.电化学检测器（electrochemical detector；ECD)

5.示差折光检测器（differential refractive index detector；DRID）

6.化学发光检测器（chemiluminescence detector;CLD)

7.质谱检测器(mass spectrometry detector;MSD)

紫外检测器（最普遍）

1.优点

⏹灵敏度高，最低检出量可达10-7～10-12 g

⏹不破坏样品，可用于制备

⏹对温度及流动相波动不敏感，可用于梯度洗脱

2.缺点

⏹只能检测具有紫外吸收或衍生物具有紫外吸收的物质