基因诊断和治疗

电泳中的迁移率不同，突变所引起的DNA构象差
异将表现为电泳带位置的差异，从而可据之作出
诊断。
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（六）PCR-SSCP（单链构象多态性）
• 方法：在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物
进行PCR扩增，然后将扩增产物用甲酰胺等变性
成单链DNA，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，然后
根据电泳带位置的差异进行诊断。 • 用途：是检测基因未知突变的常用技术，而且适 宜于大量样本的筛选，能简便、快速、灵敏地检 测有无点突变或多态性（但如欲阐明突变的碱基
检测病原体，尤其是对于潜伏性感染的病原体，可大
大提高检出率。
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（三）原 位 PCR（in situ PCR）
① 固定组织或细胞：将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被 的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过
氧化物酶。 ② 蛋白酶K消化处理：用60μg/ml的蛋白酶K将固定好的组织 细胞片55℃消化处理2h后，96℃2min以灭活蛋白酶K。 ③ PCR扩增：在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液 体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩 增。有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置。 ④ 杂交：扩增后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交。 ⑤ 观察：显微镜观察结果。
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（四）Northern印迹杂交
• 方法：将RNA经变性(非碱变性)及电泳分离后，
转移到硝酸纤维膜或其他固相支持物上，与
标记核酸探针进行杂交反应。 • 用途 ： 是分析基因表达水平的主要技术。可 用于组织细胞中总 RNA 或 mRNA 的定性、定 量分析，测知某一特定基因的表达情况。
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二、聚合酶链反应（PCR）技术
分析手段 研究途径
研究目的
分子生物学、遗传学的技术和原理
1.对DNA序列分析鉴定； 2.对mRNA分析定量。 在DNA水平分析、鉴定遗传性疾病所涉 及基因的突变（置换、缺失或插入）
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细胞膜
细胞核 DNA 转录 mRNA 翻译 蛋白质
基因诊断
生化学诊断 血清学诊断
临床表现
临床诊断
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基因诊断的特点
（一）高度的特异性 （二）检测灵敏度及精确性高 （三）可以早期快速诊断 （四）检测材料来源广
在硝酸纤维膜 ( NC)/ 尼龙膜上，与探针杂交；或把细 胞/病毒点在膜上，变性后杂交；或培养的菌落、菌斑 原位吸附于膜上，变性后杂交。
• 用途：基因组中特定基因及其表达的定性、定量分析。 • 优点：简便、快速、可在同一张膜上同时进行多样品检测。 • 缺点：不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定 比例的假阳性。
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（四）多 重 PCR
• 方法：在一次PCR反应中加入多对引物，同时扩
增DNA链上的不同序列段。扩增产物经琼脂糖电
泳和溴乙锭或荧光染色，即可直接在所显示的带 谱上进行诊断。 • 用途：主要用于一些“超大”基因中大片段缺失 的分析。 • 举例：杜氏肌营养不良症（DMD）是由于DMD
基因的9个外显子区段缺失所致，可设计相应的9
针杂交。
• 用途：可测知特定基因的存在或表达状况，还可
观察被测基因在细胞内或染色体上的定位。
• 优点：不必提取核酸避免了抽提中核酸量的损失，
因而比其他技术敏感的多，可在 1% 的细胞中检 出目的核酸序列。
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（二）斑点印迹（Spot blot ）杂交
• 方法 ：将提取的样本 DNA 或 RNA，变性后，点样吸附
也是用于鉴别诊断RNA病毒的重要技术。
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Reverse transcription-PCR(RT-PCR)原理
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（三）原 位 PCR（in situ PCR）
• 方法：不需提取DNA/RNA，直接用组织切片和细胞
进行PCR或RT-PCR反应。
• 特点：比原位杂交的灵敏度提高50～100倍，但扩增 效率不如液相PCR。 • 用途：在组织、细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定 DNA或RNA序列。既能鉴定含靶序列的细胞，又能 确定被测靶序列在细胞内或染色体上的位置。多用于
•
优点：既简化了方法，又节约了时间，且只
要极少量的基因组DNA就可进行。
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用ASO检测苯丙酮尿症（PKU）家系
亲代
子代 2Kb 患儿 突变探针杂交结果 正常探针杂交结果
突变纯合体
正常纯合体
杂合体
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三、连接酶链反应（LCR）
• 连接酶链反应（ ligase chain reaction，LCR） 又称连接扩增反应（ligation amplification）。
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（三）可以早期快速诊断
• 如结核性脑膜炎，常规培养鉴定需几周时间， 痰涂片染色镜检阳性率低，而应用 PCR 方法 确诊只需一个工作日。
• 由于人体各种组织中得到的 DNA 都是一样的，
因此，在妊娠早期取胎儿绒毛或在妊娠中期
取羊水脱落细胞提取 DNA，可进行遗传病的
产前诊断。
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（四）检测材料来源广
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基因诊断技术
点样
Probe-32P
检测
A
斑 点 杂 交
B 1 2 3 4
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（三）Southern印迹杂交
• 方法：把DNA经限制性酶切割、凝胶电泳后，再转移
到硝酸纤维膜或尼龙膜上，与标记核酸探针杂交。 • 用途：用于基因组中特定的基因或序列的定性及定量
分析，也常用于鉴定克隆DNA的特殊序列。 • 优点：既可准确保持DNA序列在电泳图谱中的位置， 又可检测出哺乳动物总基因组中特异的DNA顺序片段 （单拷贝基因），并测定其分子量。
至数小时，故既简便又经济。
• 用途：用于检测单拷贝基因或DNA片段的存在， 并常与核酸分子杂交结合，分析鉴定基因突变。
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（二）逆转录 PCR （RT-PCR）
• 方法：用提取的mRNA或总RNA（含mRNA ）
为模板，逆转录成cDNA后，再扩增cDNA。
•
用途：是检测特定基因表达水平的主要方法，
（置换、缺失或插入），则两寡核苷酸接头处
与待测DNA就会出现一个碱基错配，在变性和 退火后不再发生连接反应，最终也不会有突变 位点周围序列的扩增；相反，野生型基因在 LCR 后会发生相应序列的扩增。通过聚丙烯酰
胺电泳就可显示其差别。
• 因此，通过LCR反应，可明确区分寡核苷酸是 否与模板DNA完全互补，检测基因点突变。
第一节
基因诊断的理论依据
依据DNA生物学功能
及分子遗传学中心法则，
DNA（基因）在生物体蛋 白质合成中起主要作用， 一定结构的基因产生一定 结构的蛋白质，一切生理
和病理现象都直接或间接
地受遗传基因控制。
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基因诊断的概念
是指运用分子生物学和分子遗传学方法对生物体 的基因组DNA片段及其转录产物进行定性和定量 分析，从而对疾病作出诊断。
对扩增引物来诊断。
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基因诊断技术
☆ 多重PCR
在一个PCR体系中加入数对PCR引物，覆盖区域不重叠 用于检测同一基因多个外显子的缺失
E1 E2 E3
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（五）荧光定 量 PCR
• 一种实时监控核酸扩增的技术, 在PCR反应体系 中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR过 程进行实时监控，以此实现对初始模板的定量分 析。 • 用途：特定DNA/RNA序列的定量分析。
探针:标记的已知序列核酸片段，包括 DNA, cDNA, RNA, Oligonucleotide
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高度特异性
基因组探针
来自基因组DNA文库中有关的基 因片段，经克隆或PCR扩增获得 从相应的基因转录获得mRNA， 再通过逆转录而获得。 从病毒基因中分离；通过cDNA克隆 或基因克隆经体外转录体系制备。 在体外人工合成碱基数不多的 与基因序列互补的DNA片段。
性质，则需作序列分析）。
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（七）PCR-ASO
• ASO （ allel-specific oligonueleotide）： 等位基因特异的寡核苷酸探针。 • 当基因的突变部位和性质已完全明了时，可 以合成ASO探针，用同位素或非同位素标记 来进行诊断。 • 探针通常为长20bp左右的核苷酸。
• 机体各种组织的有核细胞均有全套基因组DNA， 都可以作为分析的材料，而不必考虑表达问题 （如β珠蛋白基因、苯丙氨酸羟化酶基因）。
• 有的遗传病至今也不了解引起疾病的基因、基
因产物和生化机理，但只要有与疾病连锁的遗 传标志即可进行诊断。
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（五）被检测基因不一定要处于活化状态
• 即使细胞中基因在静止状态时（如血斑、 精液斑中的DNA），也可被测出。
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cDNA探针
RNA探针
寡核苷酸探针
第二节
基因诊断的方法
Method of Gene Diagnosis
基因诊断的方法
核酸分子杂交技术 聚合酶链反应（PCR）技术 连接酶链反应（LCR） DNA序列分析 基因芯片技术 限制性片段长度多态性（RFLP）分析
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一、核酸分子杂交技术
（五）被检测基因不一定要处于活化状态
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（一）高度的特异性
临床诊断
疾 病 诊 断
血清学诊断 生化学诊断
以疾病表型改变为依 据，非特异、出现时 间较晚 对患者基因或DNA本 身直接进行分析，具 有高度的特异性
基因诊断
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（二）检测灵敏度及精确性高
• 待 测 标 本 用 量 少 ， PCR 方 法 可 以 检 出 pg （10-12g）水平的靶基因。 • 可从人类长达3×106kb的基因组中检测单拷 贝基因，并可检出某一基因的单碱基改变。
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（六）PCR-SSCP（单链构象多态性）
• 原理：不同的单链 DNA （即使只差 1 个碱基）有 不 同 的 空 间 构 象 ， 即 单 链 构 象 多 态 性 （ single
strand conformation polymorphism，SSCP），
这种不同构象的单链 DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶
引物、聚合酶、 dNTP、MgCl2
+
含微量靶序列 的待测物(模板)
变性、退火、延伸 循环扩增
扩增产物检测
待测物中 含靶序列
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基因诊断的条件
（一）基因诊断检测的靶物
•
DNA（基因）
分析基因的结构
• mRNA
从基因表达水平分析基因的功能
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（二）基因诊断检测的探针
基因组探针 cDNA探针 基因探针 寡核苷酸探针 灵敏显示系统 RNA探针
（一） DNA PCR
（二） RT-PCR （逆转录PCR）
（三） 原位PCR
（四） 多重PCR （五） 定量PCR （六） PCR-SSCP（单链构象多态性）
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（一）DNA PCR
• 方法：以所需扩增的基因组DNA为模板，进行
PCR反应。经扩增的DNA片段，通过电泳分离
和染色（溴乙锭或荧光染色）后，可直接在所
显示的带谱上进行诊断。 • 特点：通过PCR 20～30次的循环，可使原来 需10μg的基因组DNA才能进行的单拷贝基因 的探测，减少到ng水平。
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（一）DNA PCR
• 优点：应用PCR方法，既不需Southern转移， 又不必制作探针进行杂交及放射自显影等操作。 且原先需要一、二周才能作出的诊断可以缩短
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基因诊断的原理
基因突变：DNA缺失、插入、移码突 变、点突变 核酸杂交 基本技术 聚合酶链反应
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（一）核酸杂交
已知基因的 核酸序列 (标记） 双链DNA （含标记物） 碱基完全配对
杂交信号检测
+
待测的单链 基因组DNA
互补结合
待测DNA中 含已知基因序列
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（二）聚合酶链反应（PCR）
大量目的产物
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（七）பைடு நூலகம்CR-ASO
• 用于探测点突变时一般需要合成两种探针：
•
探针1：与正常基因序列完全一致，能与之稳
定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；
•
探针2：与突变基因序列一致，能与突变基因
序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定
杂交。
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（七）PCR-ASO
• PCR-ASO ：即先将含有突变点的基因有关片 段进行体外扩增，然后再与ASO作点杂交。
• 原理：在 LCR 体系中，需设计两对寡核苷酸探针，
使第一个探针的3’-端与第二个探针的5’-端相邻， 并 使 两 个 探 针 分 别 与 待 测 DNA 完 全 互 补 。 耐 热 DNA 连接酶就可以在第一次热变性、退火后，将 两个寡核苷酸探针连接起来。
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三、连接酶链反应（LCR）
• 如待测DNA在两寡核苷酸接头处有一碱基突变
（一）原位（in situ）杂交
（二）斑点印迹（ spot blot）杂交
（三）Southern 印迹杂交
（四）Northern 印迹杂交
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原位（ in situ ）杂交
• 方法：不需提取 DNA或 RNA，直接用培养 /采集 的细胞（涂载玻片上）、组织切片（固定载玻片
上）和细菌菌落（复印至滤膜上）与标记核酸探