组织化学定位

• 一般原则：1、对组织处理,制片过程不能影 响酶活性及分布2、所选底物和辅助物必须 迅速、同步穿透入组织和细胞中3、所选底 物最好只能被一种酶催化分解 4.所选辅助 物不影响细胞内酶的活性, 不影响其他反应 试剂的穿透性5.PRP必须迅速与辅助物反 应,FRP为水不溶性的有色稳定产物6.所有 参与反应的试剂均不能与其他成分吸附或 结合
5、 酶组织化学的主要步骤
• • • • • 1、固定或不固定的标本 2、切片(冷冻或不冷冻) 3、孵育 4、显色 5、显微镜下观察
6、各步骤注意问题
• 1、检测方法的选择 • 2、酶的保存与固定 • 一般新鲜组织快速冷冻, 冰冻切片(-70℃长 期保存；可用［丙酮∶氯仿=1∶1］4℃， 5～10分钟稍固定) • 固定剂:抑制酶活性和细胞化学成分活性的 重金属盐Hg、Cr、Pb等不能用做固定剂； 慎用醛类 • 固定方法: 浸泡固定 灌流固定 • 固定温度: 0—4℃
• • • • • • •
3、切片制作: 切片厚度<40um，一般8～12um 4、 缓冲液选择 缓冲液用于 A. 配置固定液 B. 漂洗液 C. 配置酶反应孵育液 选择缓冲液应注意 A.不能减弱目标酶的活性 B.不能含有与捕捉机 制相同的物质 • C. 注意漂洗用缓冲液的渗透压 • D. 漂洗用缓冲液原则上与固定液配置的缓冲液 相同
（一）、酶组织化学发展历史
• 1939年以前：主要研究细胞内的氧化还原 反应，未出现酶组织化学方法 • （如Klebs和Stuve 指出愈创木酯酊同脓 百度文库用能产生蓝色——过氧化物酶） • 1939年：酶组织化学真正开始 • 高松英雄和Gomori——碱性磷酸酶（硫 化钴反应、银反应） • 同年，酸性磷酸酶组织化学方法也发表
• 4、原理及一般原则 • 基本原理：细胞内的酶催化分解合适的底 物，生成中间产物（即初级反应产物）， 然后其中之一再与辅助物（或捕捉剂）反 应，生成有色不溶性的终反应产物，该反 应产物沉积在原位，以显示酶的存在
• 第一反应：酶促反应 • • 底物 初级反应产物（PRP） • 不可见 • • 第二反应：捕捉反应 • • PRP + 捕捉剂 终反应产物（FRP）
• 免疫学与组织化学：将抗原、抗体的特异 性与组织化学的可见性巧妙的结合起来， 在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质。 • 分子生物学与组织化学：将碱基配对的分 子杂交原理与组织化学结合，产生核酸原 有位置上进行的细胞内核酸定性、定位。
二、酶的组织化学定位
• 概念:用细胞内的酶具有催化底物的特性， 并通过显色反应在切片或涂片上显示组织 或细胞中内源性酶的活性及其定位的方法。 • 特点：① 在原位检测 • ② 检测酶的活性而不是酶分子本身
与其他学科的关系
• 细胞学：细胞学把细胞看作生命活动的基本单位， 从细胞、亚细胞和分子三个水平研究探索细胞的 各种生命活动规律。 • 组织学：是阐明正常情况下细胞、组织、器官和 系统的形态结构和其生理活动。 • 联系：他们都是组织化学的形态基础。
• 生物化学：一方面是进行细胞组织成分的 化学分析，另一方面是对这些成分的化学 反应分析。 • 联系：是组织化学反应原理的基础。
• 1940-1950年：酶组织化学发展的黄金时期 • 创立了金属盐法、偶联偶氮色素法 • 50年代后：电镜酶组织化学 • 将超薄切片法和电镜技术应用到酶组织 化学上，获得了酶的更精确的定位 • 60年代后期：免疫组织化学 • 利用抗原抗体特异性反应来定位酶蛋白 • 电镜免疫组化
（二）、酶的种类
• 2、酶的定位：酶在细胞内或超微结构中存 在的特定部位。 • 如：5’-核苷酸酶——浆膜 • ATPase——肌球蛋白 • 细胞膜 • 线粒体
3、酶组化的基本条件
• • • • • 同时保存结构和酶的活性 保存酶的定位，防止酶的扩散或移位 保证反应产物的特异性 * 影响酶活性的因素： 温度 PH值 抑制剂 激活剂
• 1. 氧化还原酶 • 2. 转移酶 • 3. 水解酶 • 4. 裂合酶（裂解酶） • 5. 异构酶 • 6. 合成酶（连接酶） • 目前，能用酶组织化学方法显示出来， 并可进行定性、定位和定量的酶较少，仅 200余种，因此潜力巨大
（三）、酶组织化学反应的基本知 识
• 1、酶的特性：水溶性，易扩散，难溶或不 溶于有机溶剂、有机溶剂不同程度降低酶 的活性、易受温度影响，对热耐受性弱、 对干燥耐受性强
酶组织化学定位
学院：生命科学 专业：植物学 姓名：马伟宝
一、组织化学 建立在形态学基础之上的组织化学属边缘科 学范畴,是研究细胞和组织中的化学组成、定 位与定量以及代谢状态的科学,其根本的目的 是联系形态、化学成分、功能来了解细胞或 组织的代谢变化。
（一）、研究方法
• 化学方法、类化学方法、物理学方法、显 微烧灰法等。
• 5、孵育反应 • A. 孵育液配置: • 底物浓度量要足够1∶20(V/ V); • 孵育液只能用一次，配制时要适量 • B. 孵育的温度和时间: • 37℃ 15-30min • C. 切片孵育法 -切片孵育 • -漂浮孵育
• • • • • • • •
6. 酶特异性对照实验 用酶活性抑制剂 采用无底物的孵育液 过固定或加热 用针对目标酶的激活剂 改变孵育液底物 选择PH 酶细胞内的定位差异