实验六动物染色体标本的制备与观察

实验六动物染色体标本的制备与观察
实验简介：染色体是细胞内遗传物质的载体。

骨髓细胞具有丰富的细胞质和高度的分裂能力，可直接观察到细胞周期中的各个时相。

但通常情况下，中期染色体在镜下的数量较少，如经秋水仙素处理后，分裂的骨髓细胞大多被阻断在有丝分裂中期，再经离心、低渗、固定、滴片等步骤，便可得到理想的染色体标本,用以观察中期染色体形态和染色体组型分析等实验。

实验学时3个。

一、实验目的
1.初步掌握动物骨髓染色体标本制备基本过程，了解操作步骤的原理。

2.了解常用实验动物染色体的数目及特点。

二、实验原理
染色体的分析往往是选择细胞处于活跃增殖状态，或者经过各种处理后细胞进入分裂的动物组织。

在正常动物体内，骨髓是处于不断分裂的组织之一。

给动物注射一定剂量的秋水仙碱即可使许多处于分裂的细胞停滞于中期，然后采用常规空气干燥法制备染色体，即可得到大量可分析的染色体标本。

在动物实验时，可在取材前经腹腔注射有丝分裂抑制剂，一般常用秋水仙素，这此方法对于动物的核型分析是非常有用的。

本方法简便、可靠，不需要经体外培养和无菌操作，易于推广。

因此骨髓细胞是用于动物细胞遗传学研究很好的材料。

三、实验材料
（一）材料昆明种小白鼠若干只。

（二）器材水平离心机、显微镜、刻度离心管(10m1)、注射器(1m1)、载玻片、烧杯(400m1、100m1)、试管架、镊子、剪刀、解剖刀、吸管、擦镜纸。

（三）试剂
1. 2％柠檬酸钠溶液：称取28g柠檬酸钠(柠檬酸三钠，Trisodium citrate，AR)溶解于蒸馏水中。

2. 1％柠檬酸钠溶液。

3. 200μg ／ml 秋水仙素(cochicine)
4. 姬姆萨 (Giemsa)原液(P H6.8)
Giemsa 染料(Giemsa stain) 1g
甘油(glycerine ，AR) 33ml
甲醇(methyl alcohol ，AR) 45ml
将染粉倾入乳钵，加几滴甘油，在乳钵内研磨直到无颗粒为止，此时再将全部剩余甘油使60～65℃保温箱中保温2h 后，加入甲醇搅拌均匀，保存于棕色瓶中备用。

5. 0.067mol/L 磷酸盐缓冲液(pH
6.8)
Na 2HPO 4. 12H 2O 11.81g
(或Na 2HPO 4. 2H 2O 5.92g)
KH 2P04 4.5g
溶解于蒸馏水中至1000m1。

6. 姬姆萨 (Giemsa)应用液(pH6.8)
取1ml 姬姆萨原液用9ml 0.067mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 6.8)稀释即可。

当天临时配制，一天后失效。

7. 甲酸(AR)
8. 冰醋酸(Acetic acid glacial,AR)
9．0.4％KCl(potassiumchloride ，AR)溶液
四、实验操作
1. 秋水仙素处理 动物按4μg ／g 体重的剂量经腹腔注射秋水仙素，3～4h 后杀死动物。

2. 取骨髓 取出动物后肢的胫骨和股骨，剪去两端骨骺。

将0.6～1ml 2％柠檬酸钠用1ml 注射器接上5#针头注入骨髓腔，将骨髓细胞先冲入小培养皿中，取下注射器针头，反复吸打骨髓细胞，使细胞团块分散，转入10ml 离心管。

3. 低渗处理 视骨髓量之多少，加入0.4%KCl 溶液8～10ml ，随即将离心管置37℃水浴中低渗10min 。

4. 固定 1000r ／min 离心8min 。

弃上清液，沿离心管壁缓慢加入新配制的甲
醇：冰醋酸(3：1)固定液5ml，加固定液时，注意不要冲动细胞团块。

加完固定液后，立即用吸管将细胞轻轻吸打均匀，静置固定20 min。

如此反复固定2～3次，每次20min。

5. 滴片固定的细胞经离心后，吸去上层固定液，视管底的细胞多寡加入少量新配制的固定液，将细胞团块轻轻吸打成悬液。

在干净、冰冷的载玻片上滴2～3滴上层细胞悬液，在酒精灯上文火烘干，在空气干燥30min。

6. 染色将玻片标本平放于支架上，细胞面朝上，每片滴加1：10 Giemsa应用液0.2～1m1，染色10min。

7. 冲洗在自来水管下细流水冲洗15s，洗去Giemsa应用液，用滤纸吸干玻片标本，置于显微镜观察。

五、结果
1. 在显微镜下可观察到染色体被Giemsa应用液染为紫红色或桃红色。

小鼠染色体数目2n=40。

2. 在低倍镜下可见较多的圆形的间期细胞核。

寻找染色体分散良好的中期分裂相，移至视野中央，然后用油镜观察。

在油镜下，可见40条清晰的染色体，每条染色体中，还可以见到着丝粒、染色体长臂和短臂等特征。

六、注意事项
1. 秋水仙素的注射剂量与时间对观察中期染色体的形态影响很大。

通常情况下，小鼠按4μg／g体重的剂量经腹腔注射秋水仙素，3～4h后处死小鼠，此时观察中期染色体特征明显。

注射时间过短或过长，在镜下可见间期细胞多，而中期染色体形态少。

如果在显微镜下能观察到50%～80%中期染色体，说明试验操作相当成功。

2. 由于小鼠的股骨较细，因此应细心地剥去皮肤，然后用手术剪剪去两端骨骺，用装有2％柠檬酸钠溶液的注射器针小心插入骨髓腔将溶液注射完毕，并反复从两端冲洗将骨髓冲出来，吹洗直至骨腔变白。

此外要防止注射针头阻塞。

3. 低渗处理是实验成败的关键，其目的是使细胞体积胀大，染色体松散。

低渗处理时间过长，会造成细胞破裂，染色体丢失。

低渗处理时间不足，细胞内染色
体则易聚集在一起，不能很好伸展开来，观察时无法区分和计数。

4. 固定液要现配现用。

用固定液固定染色体形态至关重要，固定时间要充分，应在20 min以上。

5. 载玻片要事前要酸液浸泡24～48h，自来水反复冲洗后，双蒸水冲洗后，烘干备用。

临用前，用洁净纸包裹置于4℃冰箱中。

6.对于离心过后的沉淀于管底中的沉淀物，要用吸管吸入固定液将细胞轻轻吸打均匀。

尤其最后一步，如果混合不均匀，可造成细胞聚集成团，在镜下就不易见到散在的中期染色体，影响染色体的后期分析。

七、作业
1. 记录所观察小白鼠骨髓细胞染色体的数目和形态。

2. 如果在实验前不给小鼠腹腔注射秋水仙素，所制备的染色体标本会出现怎样
的情况？
小鼠骨髓中期染色体形态图。