细胞凋亡磷脂酰丝氨酸外翻分析

细胞凋亡磷脂酰丝氨酸外翻分析

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磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)又称丝氢酸磷脂，二酰甘油酰磷酸丝氨酸，是一类普遍存在的磷脂，磷脂化合物中的磷酸甘油酯类，是细胞膜组分之一，与一系列的膜功能有关。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。

磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）是一种分子量为35～36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与PS有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin-V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(FITC-／PI-)；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(FITC+／PH+)：而右下象限为凋亡细胞，显现(FITC+／PI-)。

Annexin-V可作为FACS(流式细胞分选)方法筛选凋亡细胞的基础。由于融合蛋白Annexin-V-EGFP，EGFP与PS的结合比例为1：1，还可进行定量检测。除此之外，还提供生物素偶联的Annexin V，可通过常用的酶联显色反应来检测。另外，MACS公司将磁珠包被Annexin V，可采用磁分选方法筛选凋亡细胞。