生物化学与分子生物学实验原理--蛋白质的分离纯化(上)(ppt 115)
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细胞放在不锈钢的容器 中.压力破碎器配有一 合适的活塞,其在高压 下迫使细胞挤破后通过 底部的小孔.
匀浆(Homogenization)
细胞被置于一密闭的容器中 (常为玻璃).匀浆器配有一 非常合适的插头,通过其上 下及左右的往复运动来破碎 细胞.
超声(Sonication)
超声波发生器可直接浸 入到细胞悬浮物中,超 声波发生器会经振动发 出高频率的声波而使细 胞破碎.
硫酸铵沉淀 （Ammonium sulfate precipitation）
利用盐破坏离子 相互作用,且促进 蛋白表面的疏水
相互作用
盐溶、盐析 (Salting in / Salting out)
每个蛋白与盐浓度的相关溶解性曲线不尽相同 : Log S(mg/ml) = - Ks(ionic strength/2), where Ks and 、
避免极端的pH
造成蛋白化学成分的改变
高pH
一些氨基酸残基（Gln and Asn）的脱氨作用 丝氨酸及苏氨酸（Ser and Thr）残基的β－消去反应 肽健的部分水解
低pHLeabharlann Baidu
引起蛋白的沉淀及变性。 修饰的磷酸基团丢失.
缓冲液
选择一种缓冲液使其可以有效的覆盖想要pH范围。 一些缓冲液（如Tris-HCl）的pH可以发生改变。对
生物化学与分子生物学实验原理 （I）-蛋白质的分离纯化
1. 蛋白质的背景介绍 2. 蛋白质分离、纯化的目的 3. 蛋白质(粗)分离:
(I)从细胞和组织 ----天然蛋白的提取
(II)表达蛋白的提取 4. 蛋白质的纯化－色谱(液相) Chromatography
1. 背景介绍
1.1 蛋白质(Proteins)的概念 1.2 蛋白质的理化特性 1.3 其它
Transcription
AUG GCU AGGC ACU UGA
Protein:
Translation
Met-Ala-SGelry-Thr-Stop
Protein In
蛋
白
的
免
疫
学
效
~ 1 week
应
blood out
基因组, 转录组及蛋白组 ( Genome, Transcriptome and Proteome)
温度(Temperature)
蛋白质在低温（0oC）时最稳定。 提升温度 升高10oC, 酶反应速度会增加一倍.超
过30-40oC, 蛋白质极不稳定,大多数蛋白质易失 活. 一般地，蛋白在20-40oC较之于低的温度有更高的 溶解性。
沉淀 (丢弃)
破碎细胞 上清
细胞裂解
离心
细胞裂解物, 蛋白,核酸及小分子
适用于含细胞壁的细菌及植物细胞) ➢ 物理方法: 渗透压震荡, 冻溶 ➢ 机械方法: 超声,匀浆,湿磨,压力
化学破碎（Chemical Disruption）
去污剂,如: Trition X100 或 NP40能因溶解细 胞膜而使蛋白透过细胞.
去污剂能使蛋白变性而且 在细胞破碎以后必需除去.
压力破碎 （French Press）
一些组织含有Mg2+, Ca2+及 Mn2+ ions 一些螯合剂常被用于除去阳离子(2-10mM)。
e.g. (EDTA（0.1-5mmol/L ）--大多数金属离子 EGTA---Ca2+， o-phenanthroline, 邻二氮杂菲---Zn2+
螯合剂可使提取物粘度降低,使蛋白更好的溶解。
体内蛋白质的制造受控于遗传信息
DNA:
TAC CGA TCG TGA ACT
mRNA:
Transcription
AUG GCU AGC ACU UGA
Protein:
Translation
Met-Ala-Ser-Thr-Stop
基因突变对于蛋白的效应
DNA:
mRNA:
TAC CGA TCG TGA ACT
盐溶、盐析
(Salting in / Salting out)
盐溶 在低浓度时, 由于盐能屏蔽蛋白之间的电荷
-电荷相互作用,添加盐通常会增加荷电分子 的溶解性 低盐防止蛋白的沉淀,聚集.
盐析
－－在高浓度时, 由于盐与H2O竞争结合蛋 白,添加盐常降低蛋白的溶解性 高盐会除去球形蛋白的溶剂分子从而造 成盐析(蛋白沉淀).
蛋白酶抑制剂 （Protease inhibitors）
蛋白酶在动物组织及微生物中很普遍。 分离蛋白在较低的温度条件下（如4℃ ） 抑制剂的选择取决于何种蛋白酶的存在，
PMSF(苯甲基磺酰氟)，leupeptin, aprotinin ----------对抗丝氨酸蛋白酶
EDTA ------对抗金属蛋白酶; pepstatin -------对抗胃蛋白酶, 巯基蛋白酶用较高浓度的还原剂来封阻.
!! 在加入buffer中24h内,二巯基乙醇被氧化.其后 可加速蛋白的失活.
二硫苏糖醇(DTT) 储存液-- -20℃ 0.5-1.0mmol/L
TCEP －－－－sulfhydryl reductant tris(2carboxyethyl)phosphine
TCEP is significantly more stable than DTT without metal chelates such as EGTA in the buffer, whereas DTT is more stable if metal chelates are present. Thus TCEP has advantages over DTT
还原剂(Reducing agents)
氧化作用会发生.半胱氨酸,甲硫氨酸及 色氨酸的氧化.
巯基还原剂经常被应用(1-10mM)
β－巯基乙醇（ β-mercaptoethanol） 二硫苏糖醇(DTT) 还原型的谷胱甘肽（Glu-Cys-Gly） TCEP
二巯基乙醇: 5-20mmol/L , 储存液--4℃
此，必须小心，以免发生错误或变性你的蛋白。 应当在buffer所使用的温度下调节溶液的pH值
eg. Tris buffer 25℃ pKa 8.06 0℃ pKa 8.85
•保证缓冲液能与后续的过程（比如色谱）相容 •已知较好的非常有用的缓冲液(HEPES, PIPES, etc)。
离子强度（Ionic strength）
有机溶剂沉淀(Precipitation With
Organic Solvents)
•极性的有机溶剂,如:脂肪族的 醇类及酮类, 降低蛋白的溶解性.
方式
1. 减少蛋白表面的水化层和增加疏 水性的表面促进聚集.
2.降低水的介电常数 降低蛋白的溶解性.
•最常用的有:甲醇, 乙醇, 丙酮及聚乙二醇.
•丙酮,乙醇及甲醇也是非常好的脂溶性的溶剂而 被经常用在脱脂处理, 这些脱脂处理常常先于蛋 白的纯化.
白的形状及活性。
1.2 蛋白质的理化特性
每个蛋白质均有特定的等电点. 由其可解离的侧链基团所决定－－－－在一定
的pH值下，每个蛋白的荷电状况不尽一致 虽然很多蛋白质（水溶性的球蛋白）其大部分的
极性侧链基团（亲水基团）折叠在外部，但是其 表面仍有部分的疏水性区域。
1.3 其它
蛋白质是细胞生物功能的执行者 酶 细胞内外物质的运输 结构支撑物 免疫系统 细胞与细胞以及细胞与外界环境信息传递
不需要的分子
多步纯化
纯蛋白
从组织细胞中进行蛋白分离流程图
组织破碎(Tissue disruption)
除去不要的组织 搅碎 匀浆（homogenization） 研磨(vessel for extraction)
细胞破碎(Cell Disruption)
➢ 化学破碎: 碱, 有机溶剂,去污剂 ➢ 酶学手段: 溶菌酶, 葡聚糖酶,几丁质酶(常
这些影响因素在蛋白(包括表达蛋白)纯 化的整个过程中必需给予足够的重视.
pH值
缓冲液的pH对于成功提纯蛋白尤为重要 缓冲液可以抗衡蛋白质溶液中pH值的改变
一般地，纯化过程中的pH值要远离其等电点pI 的稳定范围内
酸性的蛋白 pH > 7可溶; 碱性蛋白组pH < 7可溶; 中性蛋白在偏离其等电点时可溶
----------3.2 初步纯化
热变性
•不同的蛋白有 不同的热稳定 性,且有些蛋白 可以在热变性 以后再复性.
(%)
天 然 结 构 一般蛋白
钙调蛋白
0 温度 (℃)
100
钙调蛋白是能通过热变性而获得纯化的一个很好例子
•一般的, 较小的, 荷电较高的蛋白比较大的, 疏水性越高的蛋白在较高的温度下更稳定.
•主要的不足之处-----常导致蛋白的变性 • 聚乙二醇的运用可以克服这一不足.
聚乙二醇6000 PEG 终浓度达30%, Pr达到最大量沉淀
等电点及pH沉淀
(Isoelectric Point and pH Precipitation).
∯: 常用于小规模（分析目的）制备
策略
从有机体中获得纯的蛋白
尽可能的用较少的步骤 尽可能少的丢失活力
从哪儿开始?
细胞与组织(材料来源有限，但是蛋白是天然 的状态)。
折叠均一, 可溶（主要指非膜蛋白）； 可通过差速离心分离细胞组份； 纯化可用色谱方法（chromatography）。
从哪儿开始?
function) ✓ 药物开发(Drug development) ✓ ------
3. 蛋白的纯化方法
➢ 离心(Centrifugation) ➢ 过滤(Filtration) ➢ 沉淀(Precipitation) ➢ 色谱(Chromatography) ➢ 电泳(Electrophoresis)∯
cDNA克隆（为目前蛋白来源的主要方法，但 是蛋白易形成包涵体（inclusion body））
重组蛋白基因在大肠杆菌， 昆虫细胞， 哺乳 动物细胞或植物细胞中表达。
也用差速离心及色谱方法纯化。 在重组的蛋白中可以添加‘Tags’以便于纯化。
3.1 蛋白质粗分离:(I)从细胞和组织 ----提 取
are constants.
盐溶、盐析 （Salting In and Salting Out）
o 不同的盐对于蛋白的溶解性会有不同 (NH4)2SO4是蛋白盐析时最常用的试剂.
o 理论上, 盐析时需要的盐的量直接与蛋白表面的电荷及非离 子的极性氨基酸相关.
o 沉淀想要的蛋白,必需的(NH4)2SO4的浓度源于实验的经验值. o 一般的, 蛋白越大, 需要沉淀蛋白的盐浓度越低.
1.1 蛋白质 （Proteins）
蛋白质由二十种标准氨基酸组成. 所有的氨基酸均有一共同的中心结构（α-碳原子）,并由
肽单位形成蛋白质的骨架. 氨基酸的侧链可以是非极性的，极性的，或者带电荷的.
蛋白可以折叠为一特定的形状或者保持一定的扭动。 多数蛋白的密度在1.3－1.4g/cm3 细胞经常添加磷酸基团,糖基及酰基到侧链上以改变蛋
Proteome (Protein)
Transcriptome (RNA)
Genome (DNA)
2. 蛋白质分离、纯化的目的
✓ 活力的生化分析 ✓ 蛋白的翻译后修饰（Post-translational
modifications) ✓ 相互作用和蛋白的装配(Interactions and
assembly) ✓ 三维结构(3-dimensional structure) ✓ 生物功能分析(Analysis of biological
蛋白的溶解性依赖于离子强度
高离子强度可造成蛋白的聚集或沉淀 低离子强度能影响酶的稳定性
一些蛋白对一定的离子(Na+, K+, Cl-, SO42-)有选择性（偏好性）
0.1-0.2mol/L NaCl or KCl模拟生理状 况下的离子强度.
金属离子螯合剂 (Metal ion chelators)
了解有关蛋白的必备知识
哪个物种合适？ 丰度及活力特点 大小，成本及物种的可获得状况
哪个组织合适? 对于特定的细胞哪个组织丰富 组织中哪种细胞中有这类蛋白 纯化过程中的作为应该与特定的方案相关
非常有益的信息 大小 组成
有关组织提取的影响因素
Buffer（缓冲液）pH值 inoic strength（离子强度） metal ion chelators（金属离子螯合剂） reducing agents（还原剂） protease inhibitors（蛋白酶抑制剂） Temperature（温度） tissue disruption（组织的破碎方式）
匀浆(Homogenization)
细胞被置于一密闭的容器中 (常为玻璃).匀浆器配有一 非常合适的插头,通过其上 下及左右的往复运动来破碎 细胞.
超声(Sonication)
超声波发生器可直接浸 入到细胞悬浮物中,超 声波发生器会经振动发 出高频率的声波而使细 胞破碎.
硫酸铵沉淀 （Ammonium sulfate precipitation）
利用盐破坏离子 相互作用,且促进 蛋白表面的疏水
相互作用
盐溶、盐析 (Salting in / Salting out)
每个蛋白与盐浓度的相关溶解性曲线不尽相同 : Log S(mg/ml) = - Ks(ionic strength/2), where Ks and 、
避免极端的pH
造成蛋白化学成分的改变
高pH
一些氨基酸残基（Gln and Asn）的脱氨作用 丝氨酸及苏氨酸（Ser and Thr）残基的β－消去反应 肽健的部分水解
低pHLeabharlann Baidu
引起蛋白的沉淀及变性。 修饰的磷酸基团丢失.
缓冲液
选择一种缓冲液使其可以有效的覆盖想要pH范围。 一些缓冲液（如Tris-HCl）的pH可以发生改变。对
生物化学与分子生物学实验原理 （I）-蛋白质的分离纯化
1. 蛋白质的背景介绍 2. 蛋白质分离、纯化的目的 3. 蛋白质(粗)分离:
(I)从细胞和组织 ----天然蛋白的提取
(II)表达蛋白的提取 4. 蛋白质的纯化－色谱(液相) Chromatography
1. 背景介绍
1.1 蛋白质(Proteins)的概念 1.2 蛋白质的理化特性 1.3 其它
Transcription
AUG GCU AGGC ACU UGA
Protein:
Translation
Met-Ala-SGelry-Thr-Stop
Protein In
蛋
白
的
免
疫
学
效
~ 1 week
应
blood out
基因组, 转录组及蛋白组 ( Genome, Transcriptome and Proteome)
温度(Temperature)
蛋白质在低温（0oC）时最稳定。 提升温度 升高10oC, 酶反应速度会增加一倍.超
过30-40oC, 蛋白质极不稳定,大多数蛋白质易失 活. 一般地，蛋白在20-40oC较之于低的温度有更高的 溶解性。
沉淀 (丢弃)
破碎细胞 上清
细胞裂解
离心
细胞裂解物, 蛋白,核酸及小分子
适用于含细胞壁的细菌及植物细胞) ➢ 物理方法: 渗透压震荡, 冻溶 ➢ 机械方法: 超声,匀浆,湿磨,压力
化学破碎（Chemical Disruption）
去污剂,如: Trition X100 或 NP40能因溶解细 胞膜而使蛋白透过细胞.
去污剂能使蛋白变性而且 在细胞破碎以后必需除去.
压力破碎 （French Press）
一些组织含有Mg2+, Ca2+及 Mn2+ ions 一些螯合剂常被用于除去阳离子(2-10mM)。
e.g. (EDTA（0.1-5mmol/L ）--大多数金属离子 EGTA---Ca2+， o-phenanthroline, 邻二氮杂菲---Zn2+
螯合剂可使提取物粘度降低,使蛋白更好的溶解。
体内蛋白质的制造受控于遗传信息
DNA:
TAC CGA TCG TGA ACT
mRNA:
Transcription
AUG GCU AGC ACU UGA
Protein:
Translation
Met-Ala-Ser-Thr-Stop
基因突变对于蛋白的效应
DNA:
mRNA:
TAC CGA TCG TGA ACT
盐溶、盐析
(Salting in / Salting out)
盐溶 在低浓度时, 由于盐能屏蔽蛋白之间的电荷
-电荷相互作用,添加盐通常会增加荷电分子 的溶解性 低盐防止蛋白的沉淀,聚集.
盐析
－－在高浓度时, 由于盐与H2O竞争结合蛋 白,添加盐常降低蛋白的溶解性 高盐会除去球形蛋白的溶剂分子从而造 成盐析(蛋白沉淀).
蛋白酶抑制剂 （Protease inhibitors）
蛋白酶在动物组织及微生物中很普遍。 分离蛋白在较低的温度条件下（如4℃ ） 抑制剂的选择取决于何种蛋白酶的存在，
PMSF(苯甲基磺酰氟)，leupeptin, aprotinin ----------对抗丝氨酸蛋白酶
EDTA ------对抗金属蛋白酶; pepstatin -------对抗胃蛋白酶, 巯基蛋白酶用较高浓度的还原剂来封阻.
!! 在加入buffer中24h内,二巯基乙醇被氧化.其后 可加速蛋白的失活.
二硫苏糖醇(DTT) 储存液-- -20℃ 0.5-1.0mmol/L
TCEP －－－－sulfhydryl reductant tris(2carboxyethyl)phosphine
TCEP is significantly more stable than DTT without metal chelates such as EGTA in the buffer, whereas DTT is more stable if metal chelates are present. Thus TCEP has advantages over DTT
还原剂(Reducing agents)
氧化作用会发生.半胱氨酸,甲硫氨酸及 色氨酸的氧化.
巯基还原剂经常被应用(1-10mM)
β－巯基乙醇（ β-mercaptoethanol） 二硫苏糖醇(DTT) 还原型的谷胱甘肽（Glu-Cys-Gly） TCEP
二巯基乙醇: 5-20mmol/L , 储存液--4℃
此，必须小心，以免发生错误或变性你的蛋白。 应当在buffer所使用的温度下调节溶液的pH值
eg. Tris buffer 25℃ pKa 8.06 0℃ pKa 8.85
•保证缓冲液能与后续的过程（比如色谱）相容 •已知较好的非常有用的缓冲液(HEPES, PIPES, etc)。
离子强度（Ionic strength）
有机溶剂沉淀(Precipitation With
Organic Solvents)
•极性的有机溶剂,如:脂肪族的 醇类及酮类, 降低蛋白的溶解性.
方式
1. 减少蛋白表面的水化层和增加疏 水性的表面促进聚集.
2.降低水的介电常数 降低蛋白的溶解性.
•最常用的有:甲醇, 乙醇, 丙酮及聚乙二醇.
•丙酮,乙醇及甲醇也是非常好的脂溶性的溶剂而 被经常用在脱脂处理, 这些脱脂处理常常先于蛋 白的纯化.
白的形状及活性。
1.2 蛋白质的理化特性
每个蛋白质均有特定的等电点. 由其可解离的侧链基团所决定－－－－在一定
的pH值下，每个蛋白的荷电状况不尽一致 虽然很多蛋白质（水溶性的球蛋白）其大部分的
极性侧链基团（亲水基团）折叠在外部，但是其 表面仍有部分的疏水性区域。
1.3 其它
蛋白质是细胞生物功能的执行者 酶 细胞内外物质的运输 结构支撑物 免疫系统 细胞与细胞以及细胞与外界环境信息传递
不需要的分子
多步纯化
纯蛋白
从组织细胞中进行蛋白分离流程图
组织破碎(Tissue disruption)
除去不要的组织 搅碎 匀浆（homogenization） 研磨(vessel for extraction)
细胞破碎(Cell Disruption)
➢ 化学破碎: 碱, 有机溶剂,去污剂 ➢ 酶学手段: 溶菌酶, 葡聚糖酶,几丁质酶(常
这些影响因素在蛋白(包括表达蛋白)纯 化的整个过程中必需给予足够的重视.
pH值
缓冲液的pH对于成功提纯蛋白尤为重要 缓冲液可以抗衡蛋白质溶液中pH值的改变
一般地，纯化过程中的pH值要远离其等电点pI 的稳定范围内
酸性的蛋白 pH > 7可溶; 碱性蛋白组pH < 7可溶; 中性蛋白在偏离其等电点时可溶
----------3.2 初步纯化
热变性
•不同的蛋白有 不同的热稳定 性,且有些蛋白 可以在热变性 以后再复性.
(%)
天 然 结 构 一般蛋白
钙调蛋白
0 温度 (℃)
100
钙调蛋白是能通过热变性而获得纯化的一个很好例子
•一般的, 较小的, 荷电较高的蛋白比较大的, 疏水性越高的蛋白在较高的温度下更稳定.
•主要的不足之处-----常导致蛋白的变性 • 聚乙二醇的运用可以克服这一不足.
聚乙二醇6000 PEG 终浓度达30%, Pr达到最大量沉淀
等电点及pH沉淀
(Isoelectric Point and pH Precipitation).
∯: 常用于小规模（分析目的）制备
策略
从有机体中获得纯的蛋白
尽可能的用较少的步骤 尽可能少的丢失活力
从哪儿开始?
细胞与组织(材料来源有限，但是蛋白是天然 的状态)。
折叠均一, 可溶（主要指非膜蛋白）； 可通过差速离心分离细胞组份； 纯化可用色谱方法（chromatography）。
从哪儿开始?
function) ✓ 药物开发(Drug development) ✓ ------
3. 蛋白的纯化方法
➢ 离心(Centrifugation) ➢ 过滤(Filtration) ➢ 沉淀(Precipitation) ➢ 色谱(Chromatography) ➢ 电泳(Electrophoresis)∯
cDNA克隆（为目前蛋白来源的主要方法，但 是蛋白易形成包涵体（inclusion body））
重组蛋白基因在大肠杆菌， 昆虫细胞， 哺乳 动物细胞或植物细胞中表达。
也用差速离心及色谱方法纯化。 在重组的蛋白中可以添加‘Tags’以便于纯化。
3.1 蛋白质粗分离:(I)从细胞和组织 ----提 取
are constants.
盐溶、盐析 （Salting In and Salting Out）
o 不同的盐对于蛋白的溶解性会有不同 (NH4)2SO4是蛋白盐析时最常用的试剂.
o 理论上, 盐析时需要的盐的量直接与蛋白表面的电荷及非离 子的极性氨基酸相关.
o 沉淀想要的蛋白,必需的(NH4)2SO4的浓度源于实验的经验值. o 一般的, 蛋白越大, 需要沉淀蛋白的盐浓度越低.
1.1 蛋白质 （Proteins）
蛋白质由二十种标准氨基酸组成. 所有的氨基酸均有一共同的中心结构（α-碳原子）,并由
肽单位形成蛋白质的骨架. 氨基酸的侧链可以是非极性的，极性的，或者带电荷的.
蛋白可以折叠为一特定的形状或者保持一定的扭动。 多数蛋白的密度在1.3－1.4g/cm3 细胞经常添加磷酸基团,糖基及酰基到侧链上以改变蛋
Proteome (Protein)
Transcriptome (RNA)
Genome (DNA)
2. 蛋白质分离、纯化的目的
✓ 活力的生化分析 ✓ 蛋白的翻译后修饰（Post-translational
modifications) ✓ 相互作用和蛋白的装配(Interactions and
assembly) ✓ 三维结构(3-dimensional structure) ✓ 生物功能分析(Analysis of biological
蛋白的溶解性依赖于离子强度
高离子强度可造成蛋白的聚集或沉淀 低离子强度能影响酶的稳定性
一些蛋白对一定的离子(Na+, K+, Cl-, SO42-)有选择性（偏好性）
0.1-0.2mol/L NaCl or KCl模拟生理状 况下的离子强度.
金属离子螯合剂 (Metal ion chelators)
了解有关蛋白的必备知识
哪个物种合适？ 丰度及活力特点 大小，成本及物种的可获得状况
哪个组织合适? 对于特定的细胞哪个组织丰富 组织中哪种细胞中有这类蛋白 纯化过程中的作为应该与特定的方案相关
非常有益的信息 大小 组成
有关组织提取的影响因素
Buffer（缓冲液）pH值 inoic strength（离子强度） metal ion chelators（金属离子螯合剂） reducing agents（还原剂） protease inhibitors（蛋白酶抑制剂） Temperature（温度） tissue disruption（组织的破碎方式）