链霉菌培养

1．棒状链霉菌Mg2+ 0mM—0.4mM

培养基组成为：大豆粉、FeS04．7H20、鸟氨酸、甘油、KH2P04和MgS04．7H20含量分别为38．1029／1、O．3959／1、1．1779／1、18．75鲋、O．1259a和0．25刨。

采用ISPl培养基活化菌种，于28"C、200r／min培养48h后，以5％的接种量转接发酵

培养基，于28℃、200r／min培养。

[SPl培养基为(g／1)：胰蛋白胨5，酵母提取物3，pH6．5。发酵培养基组成为(g／1)：

甘油16．88、KH2P04 0．13、大豆蛋白胨33．60、MgSO,·7H20 0．2、FeS04·7H20 0．3、鸟氨

酸1．32、MOPS 21。

2. 始旋链霉菌

优化后的发酵培养基组成为：可溶性淀粉3．0％，蔗糖1．0％，葡

萄糖O．5％、麦芽糖0．8％、黄豆饼粉1．2％、蛋白胨O．4％、鱼粉1．2％、酵母粉0．6％、(NH4)2S04 0．2％、MgS04 0．35％，KH2P04 O．02％、CaC03

0．4％，NaN03 o．075％；优化的摇瓶培养条件为：初始pH值为6．5，在25

mL／250 mL三角瓶中以6％接种量接入经过36 h培养的种子培养液，在

25。C，220 rpm条件下进行培养60 h

斜面培养基：可溶性淀粉1．5％，黄豆饼粉1％，缬氨酸0．05％，K2HP04

O．05％，NaCl 0．2％，MgS04 0．05％，琼脂2．0％。调节pH

值为6．5，在28℃及空气湿度40％条件下培养7．1 0 d。

平板培养基：配方同斜面培养基

种子培养基：可溶性淀粉1．5％，葡萄糖l％，黄豆饼粉1．5％，蛋白胨O．5

％，酵母粉0．5％，KN01 0．25％，NaCl 0．2％，

CaC03 0．4％，琼脂0．1％。调节pH值为pH 7．0—7．2，在28℃、摇床转速220 rpm条件下培养40 h。

发酵培养基：可溶性淀粉4％，葡萄糖1％，黄豆饼粉1．5

％，蛋白胨0．5％，鱼粉1％，酵母粉0．3％，(NH4)2S04 0．2％，

MgS04 O．35％，KH2P04 O．02％，CaC03 O．4％，NaN03 0．075％，

调节pH值为pH 7．0，在28℃，220 rpm条件下培养60 h。

菌丝培养基：种子培养基+甘氨酸(一定浓度)

再生培养基：KH2P04 O．025％，蔗糖10．3％，MgCl2-6H20 1．012％，葡萄

糖1．O％，蛋白胨O．01％，酵母膏O．5％，微量元素溶液0．2

mL／100mL，TES溶液1．0 mL／100mL，琼脂粉2．0％。

分装250 mL于500 mL锥形瓶中，然后分别加入单独灭菌的

KH2P04(0．5％)2．5 mL，CaCl2·2H20(2．5 N)2．0 mL和NaOH

(1．0 N)1．75 mL。

在28℃、空气湿度40％条件下培养10．14 d。

将冻干管中的孢子周无菌水洗出后接种到斜面培养基上培养。待孢子

生长成熟后进行如下操作步骤o．

(a)在斜面上加入9 mL无菌水，用棉签轻轻洗下孢子，使孢子悬浮于无菌水中；

(b)将洗下的孢子悬液倒入装有1 o颗直径为2—3 mm玻璃珠的三角瓶

中，放在摇床上220 rpm，振荡l h左右；

(c)脱脂棉过滤孢子悬液，除去菌丝片段和固体培养基碎片；

(d)3000 rpm离心1 5 min以使孢子沉淀，马上倒掉上清液；

(e)将离心管在振荡器上振荡几秒钟使孢子沉淀物分散于残存的无

菌水中；

(f)加入无菌的40％甘油和5％乳糖，．20。C冷冻保藏。

使用前需洗涤两次，充分去除甘油对孢子活力的影响。

2．2．7菌丝体的培养和收集

(1)从成熟的斜面上挑取大约l cm2大小的菌落接种到装有25 mL含有

不同浓度甘氨酸的种子培养基的三角瓶(250 mL)中，28℃、220 rpm

条件下震荡培养42—48 h；

(2)取样镜检是否染菌；

(3)取l 0 mL培养好的上述种子液于l 5 mL的无菌离心管中，4000 rpm

离心10 min，弃去上清夜，收集菌丝体。然后加入1 0 mL无菌水，

用玻璃棒搅匀后倒入装有20颗直径2．3 mm玻璃珠的250 mL三角

瓶(灭菌)中，在220 rpm的转速下震荡30 min，以使菌丝体能够

充分打碎；

(4)震荡结束后吸取10 mL菌液于1 5 mL离心管(灭菌)中，4000 rpm

离心1 0 min，弃去上清液；

(5)在上述l 5 mL离心管中加入5 mL高渗溶液，用玻璃棒搅匀，洗涤

菌丝体。离心，弃去上清液，再用高渗溶液洗涤一次，离心，弃去

上清液，连续洗涤直到洗液透明无色，然后离心沉淀菌丝体，最后

将菌丝体悬浮于5 mL高渗溶液中．

2．2．11还原糖和总糖测定

发酵液中所含的还原糖和总糖浓度，采用DNS法测定。

(1)DNS试剂配制：见2．2．3。

(2)标准曲线的制作：

a．配制浓度为O．1 g／L、0．2 g／L、O．3 g／L、0．4 g／L、0．5 g／L、0．6 g／L、

0．7 g／L、0．8 g／L、0．9 g／L，1．0 g／L的标准葡萄糖溶液。

b．在试管中加入1 mL标准葡萄糖溶液，3 mL DNS试剂，沸水浴5分

钟，冷却至室温后，加水至25 mL，摇匀。以水为空白测540 nm处的吸光

度。

C．吸光度 OD540nm

DNS试剂：

称取酒石酸钾钠182．0 g，溶于500 mL蒸馏水中，加热(不超过50。C)，于

热溶液中依次加入3，5．二硝基水杨酸6．3 g，NaOH 21．0 g，苯酚5．0 g，无水亚硫酸钠5．0 g，搅拌至溶解完全，冷却后用蒸馏水定容至1000 mL，贮存于棕色瓶中，室温保存．

还原糖的测定：取离心并适当稀释后的样品1 mL，加3 mL DNS

试剂，沸水浴5 min，冷却至室温后，加水至25 mL，摇匀。以水为空白

测540 nm处的吸光度A。根据标准曲线计算出其浓度，再乘以稀释倍数，

就得到样品中的还原糖浓度。