免疫荧光步骤注意事项

（一）免疫组化组织细胞的固定

凡需进行病理研究的标本均需进行固定。将组织置于某些化学试剂中，使细胞内的物质免疫组织化学实验技术及应用尽量接近于其生活状态时的形态结构和位置称为固定。而用于免疫组化研究标本的固定不仅是使细胞内的蛋白质凝固，终止或减少外源性和内源性细胞内分解酶的反应，防止组织细胞自溶，更重要的是保存组织或细胞内的抗原性，使抗原不失活，不发生弥散。

不同的抗原，其抗原稳定性不同，依抗原耐受固定液的程度可分为：①不稳定性抗原，如T淋巴细胞表面抗原属此类抗原，一般以冰冻切片进行免疫组化染色；②半稳定性抗原，如B淋巴细胞的胞浆免疫球蛋白等；③较稳定抗原，例如HBsAg、HBcAg、AFP、CEA、S—100、Keratin和部分多肽类激素等，其抗原性受固定剂种类、固定时间、温度等影响不大。

固定剂的种类很多，性能不一，因此固定不同的组织应选择合适的固定剂，特别是标记半稳定抗原时，更要选择合适的固定剂和固定条件。

固定液的种类

较好的固定液应具有强渗透力，能迅速渗入至组织内部；其次不会使组织发生过度收缩变形，并能使组织内易观察的成分得以凝固为不溶性物质；还要使组织达到一定硬度，有较好的折光率。固定液分为简单固定液和混合固定液。因目前大多数固定液都是有毒有机溶剂组成，欧美国家已不再使用，基本由环保组织固定液替代。西奈山环保组织固定液由植物多糖、乙醇、醋组成，固定效果明显优于常规甲醛。

固定的方法

1．浸泡法

这是最常用的固定法，将取好的组织直接浸泡在固定液中，固定的时间一般在2～24h它适用于动物标本、尸检标本及临床活检标本等。

2．蒸气法

比较小而薄的标本可用锇酸或甲醛蒸气固定。主要用于血液、细胞涂片以及某些薄膜组织的固定。具体方法：在一有盖培养皿内滴人1％一2％锇酸水溶液3滴，将涂片放人其中，固定30s至lmin左右，立即水洗后进行染色。

3.注射、灌注固定法

主要适用于动物实验标本的固定。将固定液注入血管，以达到充分的固定。经血管分支到达整个组织或全身

(1)局部灌注固定固定肺组织可将固定液从气管或支气管注入，注入速度不要太快，用力均匀，注入量适当，以免胀破肺泡。固定眼球组织可从眼后房注人固定液。固定肝、肾组织则可从肝、肾动脉注入固定液，同时切断其静脉使得血液排出。脑组织的固定，必须先麻醉动物，分离颈动脉，注射器的针尖向着头部的方向注入固定液。

(2)全身灌注固定较大的动物往往采取输液方法，将固定液从一侧颈总动脉或股动脉输入，将另一侧相应的静脉切开放血。固定液的输入量因动物而异，兔、猫约500～1000ml，猴、狗约1000—2000ml。

4．微波固定法

近几年来微波固定法一直可见报道。经微波固定的组织具有收缩较小、核膜清晰、染色质均匀、分辨清晰等特点，但必须严格控制微波固定的时间和温度。

固定的注意事项

1．固定液的量

固定组织时，必须有足够的固定液，一般为组织块体积的10～15倍。固定用的容器必须足够大，组织材料不要太多，避免组织中的水分渗出而影响固定液的浓度。

2.固定的组织必须新鲜

组织取材后应立即固定，否则，组织易收缩变形，并发生自溶现象。

3.组织块的体积

组织块的体积宜小而薄，一般用于免疫组化的组织大小宜为1．OcmXl．OcmX 0．2cm。组织太大，内部得不到充分固定，导致组织结构破坏，给切片带来一定的困难，还增加非特异染色，同时浪费试剂。

4．组织固定后的冲洗

组织固定后，因固定液渗到组织中，所以必须彻底冲洗，除去固定液，否则会影响下一步的脱水。特别对于长时间固定的标本应用流水冲洗，尽可能减少色素沉着。对于混合固定液固定的组织，更要及时冲洗，否则将影响免疫组化切片的质量。

影响固定的因素

1．温度

一般固定液固定效果随温度升高而加强，温度一般在-70～37℃之间，•以室温22℃常用。某些酶的固定要求在37℃以下进行，而某些病毒的固定则要在低温下进行，如用环保组织固定液在-20一-4℃之间固定30min最佳。对于临床活检标本，固定时间要求短，实践发现用环保组织固定液在40℃左右固定2～3h即可。

2．浓度

10％中性甲醛、4％多聚甲醛最合适，乙醇最常用浓度为95延。在37℃或室温固定，适合于许多蛋白质、抗原，并能保持其与抗体的反应能力。70％的乙醇固定能力最强。

3．固定时间

固定时间要视组织块的大小及固定液的种类、浓度、温度而定。组织块越大，固定时间越长；反之，组织块越小，固定时间越短。固定液的穿透力与浓度成正比，固定的时间与温度成反比。总之，固定的时间应根据条件而定。没有任何一种固定液适合于所有组织的固定，应根据条件选择合适的固定液，可以用多种固定液固定作对比，找到比较切合本单位实际的固定液。

（二）BSA封闭原理

封闭血清的原理主要有两点，第一是待检样本会非特异性的和蛋白结合，从而导致背景过高，因此可以用BSA或血清封闭掉这部分非特异性的结合，从这点看，BSA和血清没有明显区别。第二是待检样本中可能会有Fc受体，可以和抗体恒定区结合，与抗体特异性无关，封闭血清中有抗体，因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本Fc受体之间结合。BSA则无法封闭Fc受体。

不能用来自一抗同物种的血清举个例子就清楚了，比如一抗是鼠抗人的抗体，二抗是兔抗鼠的抗体，你要用鼠血清封闭的话，二抗就和封闭用的鼠血清里面的鼠

抗体反应了，那不就假阳性了嘛。

组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色，最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶元和结缔组织成分上。最有效方法是在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清(1:5~1:20) 封闭组织上带电荷基团而除去与第一抗体非特异性结合。必要时可加入2%~5% 牛血清白蛋白（胎牛血清最好），可进一步减少非特异性染色。作用时间为10~20min。也可用除制备第一抗体以外的其它动物血清(非免疫的)。有明显溶血的血清不能对消除背景的非特异性染色有很好的效果。

支持介质会非特异的结合某些蛋白，其中就包括你的一抗，封闭液可以与非特异位点结合，减少或几乎没有一抗的非特异性结合。一般可以选择BSA、脱脂奶粉等。可能的话使用二抗来源动物的血清效果会更好，尤其是在免疫荧光中

（三）Triton透膜

（1）Triton X-100化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种去污剂。在免疫组织化学（>10um厚切片）和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。

（2）其作用原理：Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。

（3）Triton X-100既是一种表面活性剂，也有抗氧化作用。