每个杂交瘤细胞
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温故知新
1.什么是细胞融合？
采用自然或人工的方法使两个或多个不同细胞融合成一个细胞。
2.诱导细胞融合的方法有哪一些？
生物法（病毒诱导融合） 诱导方法： 化学法（聚乙二醇诱导融合） 物理法( 电场诱导融合)
3.植物体细胞杂交技术是细胞融合的应用之一，他的原 理是什么 ？有什么优势？
原理：细胞的全能性、细胞膜的流动性 优势：克服了远缘杂交不亲和的障碍，创造新物种，定向 改造生物性状。
三.动物细胞融合与单克隆抗体
1、定义：在一定的条件下法使两个或多个不同的动物细 胞融合成陈一个细胞的过程。
（一）动物细胞融合
受精作用
两个细胞正在融合
2.诱导融合的方法
• 生物法：灭活的病毒诱导融 合.(利用灭活仙台病毒是动物细
胞融合所特有的。 这是由于病毒 的磷脂外衣与动物细胞的膜十分 病毒颗粒黏 附细胞表面
4）、如何进行第2次筛选？ 培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。
2、单克隆抗体的优点：
特异性强，灵敏度高，可大量制备。 3、单克隆抗体的应用
• 1、作为诊断试剂：在临床生化诊断、病理组织定位、
体内肿瘤的定位等,与常规抗体相比,具有准确、高效、 简易、快速特点. • 2、用于治疗疾病和运载药物： • 主要用于癌症治疗。
• 生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体+放射性同位素+化学
药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细
胞位置，原位杀死癌细胞。）
例题1：
1975年，英国剑桥大学分子生物 学实验室的科勒和米尔斯坦，把小 鼠的淋巴细胞（脾细胞）和小鼠的 骨髓瘤细胞融合起来，成为杂交瘤 细胞，实现在体外大量生产抗体的 目的。实验过程如图所示。
(1)淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细胞，两种细胞膜也能“融合” 在一起，说明细胞膜 具有一定的流动性 。 (2)单克隆抗体的准确定义应为 ( C ) A．一类特殊抗体 B．无性繁殖系 C．单一抗体细胞的无性繁殖第产生的抗体 D．单一抗体细胞的有性繁殖系产生的抗体 (3)杂交瘤细胞繁殖进行的是_______ 。 有丝 分裂，其遗传性状__________ 不变 (4)单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原(病原体或癌变细胞等)并 与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为“生物导弹”这是利用了 _____________ 。 抗体能与抗原发生特异性结合的特点
选择性培养基 筛选1 专一抗 体检测 克隆化 多种杂 交细胞
1.注射抗原的目的 是什么？
有限稀释法培养 筛选2 单克隆 抗体
注射抗原
B淋巴细胞 融合 骨髓瘤细胞
选择性培养基 筛选1 专一抗 体检测 克隆化 多种杂 交细胞
2.诱导细胞融合的 手段有哪些？
有限稀释法培养 筛选2 单克隆 抗体
注射抗原
进行“单一抗体检测”，“检测阳性”的孔内即是所需要的杂
交瘤细胞。 6. 选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养或注射到小鼠腹腔 内增殖。提取单克隆抗体。
问题强化：
1）、本过程利用了哪些原理？ 免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理 2）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？ 这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质， 不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的 本领，因而可以获得大量单克隆抗体 3）、为何要进行两次筛选？ 第1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2次筛选得 到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。
胞是一个系列。（B1,B2,B3,---Bn） 细胞融合——三种融合方式:（BB;BG;GG） 第一次筛选：在“选择培养基培养”上培养筛选杂交瘤细胞 （只有BG杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：
如B1G,B2G---BnG。而BB,GG在此培养基上不能存活。）
5. 第二次筛选：在“多孔培养板上”培养杂交瘤细胞系列 ，每 孔只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并
有限稀释法培养 筛选2 单克隆 抗体
5.实际操作中如何经过两次筛选获得能产生特异 性抗体的杂交瘤细胞？
稀释
有限稀释法 稀释多次
将培养皿孔内的上清液取出，检测抗体。常用的方法 有：酶联免疫吸附试验和免疫荧光测定。
1.
动物特异性免疫
2.
3. 4.
分离B淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（G）。注意B淋巴细
3.一个大胆的猜想
将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能 力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交 瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一 的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原 决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。
米尔斯坦(阿根廷)和科勒(德国)因此在1984年获诺贝尔奖。
相似的缘故。病毒外壳上的某些
糖蛋白可能还有促进细胞融合的 功能。)
细胞膜被 病毒颗粒穿通
• 化学法：聚乙二醇PEG诱导融
合.
细胞膜连接
• 物理法：电刺激融合
细胞融合、形成杂种细胞
思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的 病毒需要灭活？不灭活行吗？
因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂 质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭 活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。
4.单克隆抗体的制备
4.单克隆抗体的制备
经免疫的小鼠
提取
B淋巴细胞
小鼠骨髓瘤细胞
灭活的病毒等手段
杂交 细胞
用特定的选 ຫໍສະໝຸດ Baidu性培养基
第一次筛选
杂交瘤细胞 第二次筛选 能产生特定抗体、培养条件 下能无限增殖的杂交瘤细胞
单抗 的制 备过 程要 点：
注射到小鼠腹腔
体外培养
提取单克隆抗体
注射抗原
B淋巴细胞 融合 骨髓瘤细胞
B淋巴细胞 融合 骨髓瘤细胞
3.若细胞两两融合后， 有几种融合情况？
多种杂 交细胞
选择性培养基 筛选1 专一抗 体检测 克隆化
有限稀释法培养 筛选2 单克隆 抗体
注射抗原
B淋巴细胞 融合 骨髓瘤细胞
4.第一次筛选出的杂交瘤
选择性培养基 筛选1 专一抗 体检测 克隆化 多种杂 交细胞
细胞为何需进行克隆化培 养和专一抗体检测？
（二）动物细胞融合的应用—单克隆抗体的制备
1.传统获得抗体的方法 动 物 体 内 多 种 效 应 B 细 胞 多 种 抗 体
抗 原
从 血 清 中 分 离 抗 体
缺点： 产量低、纯度低，且抗体的 特异性差、灵敏度低。
2.一个美丽的发现
在动物免疫反应的过程中，体内的B细胞可以产生多达 百万种以上的特异性抗体，但是每一种B细胞只产生一 种抗体，想要获得大量的单一的抗体，必须对单个B细 胞进行无性，即克隆。
1.什么是细胞融合？
采用自然或人工的方法使两个或多个不同细胞融合成一个细胞。
2.诱导细胞融合的方法有哪一些？
生物法（病毒诱导融合） 诱导方法： 化学法（聚乙二醇诱导融合） 物理法( 电场诱导融合)
3.植物体细胞杂交技术是细胞融合的应用之一，他的原 理是什么 ？有什么优势？
原理：细胞的全能性、细胞膜的流动性 优势：克服了远缘杂交不亲和的障碍，创造新物种，定向 改造生物性状。
三.动物细胞融合与单克隆抗体
1、定义：在一定的条件下法使两个或多个不同的动物细 胞融合成陈一个细胞的过程。
（一）动物细胞融合
受精作用
两个细胞正在融合
2.诱导融合的方法
• 生物法：灭活的病毒诱导融 合.(利用灭活仙台病毒是动物细
胞融合所特有的。 这是由于病毒 的磷脂外衣与动物细胞的膜十分 病毒颗粒黏 附细胞表面
4）、如何进行第2次筛选？ 培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。
2、单克隆抗体的优点：
特异性强，灵敏度高，可大量制备。 3、单克隆抗体的应用
• 1、作为诊断试剂：在临床生化诊断、病理组织定位、
体内肿瘤的定位等,与常规抗体相比,具有准确、高效、 简易、快速特点. • 2、用于治疗疾病和运载药物： • 主要用于癌症治疗。
• 生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体+放射性同位素+化学
药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细
胞位置，原位杀死癌细胞。）
例题1：
1975年，英国剑桥大学分子生物 学实验室的科勒和米尔斯坦，把小 鼠的淋巴细胞（脾细胞）和小鼠的 骨髓瘤细胞融合起来，成为杂交瘤 细胞，实现在体外大量生产抗体的 目的。实验过程如图所示。
(1)淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细胞，两种细胞膜也能“融合” 在一起，说明细胞膜 具有一定的流动性 。 (2)单克隆抗体的准确定义应为 ( C ) A．一类特殊抗体 B．无性繁殖系 C．单一抗体细胞的无性繁殖第产生的抗体 D．单一抗体细胞的有性繁殖系产生的抗体 (3)杂交瘤细胞繁殖进行的是_______ 。 有丝 分裂，其遗传性状__________ 不变 (4)单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原(病原体或癌变细胞等)并 与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为“生物导弹”这是利用了 _____________ 。 抗体能与抗原发生特异性结合的特点
选择性培养基 筛选1 专一抗 体检测 克隆化 多种杂 交细胞
1.注射抗原的目的 是什么？
有限稀释法培养 筛选2 单克隆 抗体
注射抗原
B淋巴细胞 融合 骨髓瘤细胞
选择性培养基 筛选1 专一抗 体检测 克隆化 多种杂 交细胞
2.诱导细胞融合的 手段有哪些？
有限稀释法培养 筛选2 单克隆 抗体
注射抗原
进行“单一抗体检测”，“检测阳性”的孔内即是所需要的杂
交瘤细胞。 6. 选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养或注射到小鼠腹腔 内增殖。提取单克隆抗体。
问题强化：
1）、本过程利用了哪些原理？ 免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理 2）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？ 这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质， 不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的 本领，因而可以获得大量单克隆抗体 3）、为何要进行两次筛选？ 第1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2次筛选得 到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。
胞是一个系列。（B1,B2,B3,---Bn） 细胞融合——三种融合方式:（BB;BG;GG） 第一次筛选：在“选择培养基培养”上培养筛选杂交瘤细胞 （只有BG杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：
如B1G,B2G---BnG。而BB,GG在此培养基上不能存活。）
5. 第二次筛选：在“多孔培养板上”培养杂交瘤细胞系列 ，每 孔只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并
有限稀释法培养 筛选2 单克隆 抗体
5.实际操作中如何经过两次筛选获得能产生特异 性抗体的杂交瘤细胞？
稀释
有限稀释法 稀释多次
将培养皿孔内的上清液取出，检测抗体。常用的方法 有：酶联免疫吸附试验和免疫荧光测定。
1.
动物特异性免疫
2.
3. 4.
分离B淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（G）。注意B淋巴细
3.一个大胆的猜想
将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能 力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交 瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一 的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原 决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。
米尔斯坦(阿根廷)和科勒(德国)因此在1984年获诺贝尔奖。
相似的缘故。病毒外壳上的某些
糖蛋白可能还有促进细胞融合的 功能。)
细胞膜被 病毒颗粒穿通
• 化学法：聚乙二醇PEG诱导融
合.
细胞膜连接
• 物理法：电刺激融合
细胞融合、形成杂种细胞
思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的 病毒需要灭活？不灭活行吗？
因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂 质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭 活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。
4.单克隆抗体的制备
4.单克隆抗体的制备
经免疫的小鼠
提取
B淋巴细胞
小鼠骨髓瘤细胞
灭活的病毒等手段
杂交 细胞
用特定的选 ຫໍສະໝຸດ Baidu性培养基
第一次筛选
杂交瘤细胞 第二次筛选 能产生特定抗体、培养条件 下能无限增殖的杂交瘤细胞
单抗 的制 备过 程要 点：
注射到小鼠腹腔
体外培养
提取单克隆抗体
注射抗原
B淋巴细胞 融合 骨髓瘤细胞
B淋巴细胞 融合 骨髓瘤细胞
3.若细胞两两融合后， 有几种融合情况？
多种杂 交细胞
选择性培养基 筛选1 专一抗 体检测 克隆化
有限稀释法培养 筛选2 单克隆 抗体
注射抗原
B淋巴细胞 融合 骨髓瘤细胞
4.第一次筛选出的杂交瘤
选择性培养基 筛选1 专一抗 体检测 克隆化 多种杂 交细胞
细胞为何需进行克隆化培 养和专一抗体检测？
（二）动物细胞融合的应用—单克隆抗体的制备
1.传统获得抗体的方法 动 物 体 内 多 种 效 应 B 细 胞 多 种 抗 体
抗 原
从 血 清 中 分 离 抗 体
缺点： 产量低、纯度低，且抗体的 特异性差、灵敏度低。
2.一个美丽的发现
在动物免疫反应的过程中，体内的B细胞可以产生多达 百万种以上的特异性抗体，但是每一种B细胞只产生一 种抗体，想要获得大量的单一的抗体，必须对单个B细 胞进行无性，即克隆。