人胰岛素和胰岛素原单克隆抗体制备及分析_刘士德
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用与筛选时相同的 EL ISA间接法测定抗体效价.
2 结 果
211 几种胰岛素免疫原与胰岛素原免疫原的免疫 效果
从 EL ISA 检测的抗胰岛素和胰岛素原的血清效 价可以看出 (见表 1 中鼠抗血清效价 ) , 不同形式 的胰岛素免疫原 , 即颗粒性胰岛素 、自交联胰岛
342
深圳大学学报理工版
固相抗原 EL ISA 间接法筛选有杂交瘤克隆生长 的上清 , 酶标结合物为 HRP2羊抗鼠 IgG. 用 0105 mol/L pH 值为 916的 Na2 CO3 2N aHCO3 缓冲液配制 5 μg /mL 的抗原溶液 , 在 PVC96 孔板上 , 每孔加 50 μL抗原溶液 , 室温作用 2 h或 4℃过夜 ; 将抗原吸 出 , 用洗涤液 ( Tris2HC l2Tween缓冲液 0102 mol/L ,
第 22卷 ,第 4期 2005年 10月
深圳大学学报理工版 JOURNAL OF SHENZHEN UN IVERSITY SC IENCE AND ENGINEER ING
Vol122, No14 Oct1 2005
文章编号 : 100022618 (2005) 0420340205
人胰岛素和胰岛素原单克隆抗体制备及分析
胰岛素不 交联 : 取 5 mg 胰 岛 素 加 1 mL 011 mol/L PBS (pH值为 618) 溶解.
胰岛素原 : 取 5 mg胰岛素原加 1 mL 011 mol/L PB S (pH值为 618) 溶解. 11212 小鼠免疫及细胞融合
选取 8～10周龄的 BALB / c小鼠 , 取抗原溶液 加等量 FCA 混合 , 按脚掌 、颈 、背部皮下多点注射 抗原 015 mL /只鼠 (按每只鼠 100μg胰岛素或胰岛 素原 ) , 3周后将等量抗原加 F IA 后进行第二次多 点注射免疫 ; 再过 3 周后腹腔加强免疫等量抗原 ; 一周后取其脾脏进行融合. 采用常规杂交瘤技术取 免疫脾细胞与 NS21骨髓瘤细胞 (10∶1) 在 1 mL 的 促融合剂 ( PEG4000 的质量浓度为 4715% ; DM SO 的质量浓度为 215% ) 中进行融合 , 在加有 5000个 腹腔饲养细胞 /孔的 96 孔板上 , 在 HAT选择培养 液中培养 4 d 后观察细胞的生长情况 , 10 d 后用 EL ISA 方法检测阳性孔. 11213 阳性杂交瘤细胞的检测
应用 “Mouse Typer”Kit (B io2Rad) 测定单克 隆抗体的类别. 以卵白蛋白 (OVA ) 为无关抗原 , 应用 EL ISA 鉴定单克隆抗体类别特异性. 11216 单抗腹水的制备
用降植 烷 ( Pristane ) 作 为 小 鼠 荷 瘤 刺 激 剂 (每只 015 mL ) , 7 d后 , 腹腔内注入 5 ×106 个生长 良好的杂交瘤细胞 , 1～2周后抽吸腹水 ; 继续饲养 重复抽取 2次 , 腹水在 37℃孵育 1 h后 , 4℃过夜 , 次日 3000 g离心 10 m in, 上清即为含单克隆抗体的 腹水. 11217 单抗腹水抗体效价测定
⑤HAT选择培养液 : 20%胎牛血清 , 1 ×HAT, 基础培养基用 PRM I1640. 112 方 法 11211 抗原的制备
胰岛素与 B SA 交联 : 取 5 mg胰岛素加 400 μL
收稿日期 : 2005208218 基金项目 : 深圳市科研基金资助项目 (199908) 作者简介 : 刘士德 (19622) , 男 (汉族 ) , 吉林省公主岭市人 , 深圳大学副教授 、博士. E2mail: liusd@ szu1edu1cn
第 4期
刘士德 , 张建华 , 等 : 人胰岛素和胰岛素原单克隆抗体制备及分析
341
011 mol/L HC l溶解 , 再加 3 μL 2 mol/L NaOH 调 pH 值 , 浑浊现象摇后消失 , 再加 100μL 011 mol/L PB S (pH 值为 618 ) 混匀. 另取 5 m g B SA 加 500 μL 011 mol/L PB S (pH 值为 618) 溶解后与胰岛素 溶解液混匀 , 再加 50 μL 体积浓度为 1%的戊二醛 溶液混匀 , 22 ～25℃震荡水浴 2 h, 透析后根据透 析液的体积计算抗原的含量.
第 22卷
素 、胰岛素 - FγG、胰岛素 - BSA 和胰岛素原免疫 原 , 均可以获得有效的免疫 , 其中以自交联的胰岛
素免疫的抗血清效价最高 , 而颗粒性胰岛素免疫容 易导致小鼠低血糖死亡.
免疫原 鼠抗血清效价 融合率 / % 阳性孔率 / %
表 1 胰岛素及胰岛素原的免疫效果及单克隆抗体细胞株的建立 Table 1 The imm unoreaction of in sulin an tigen s and pro2in sulin,
the ra tio of cloned hybr idoma s wells and the ra tio of excreting an tibody wells
颗粒性胰岛素
自交联胰岛素
胰岛素 - FγG
胰岛素 - BSA
1∶1000
1∶4000
1∶2000
1∶2000
67. 8 15. 6
74. 5 16. 6
pH 值为 712) 洗涤 2次 ; 每孔加质量浓度为 3%的 B SA 100μL , 室温作用 2 h, 洗涤 2次 ; 加入 50μL 杂交瘤培养上清 , 室温作用 1 h, 洗涤 2 次 ; 每孔 加入 1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG 质量浓度为 3%的 B SA / PB S 50 μL , 室温作用 1 h, 洗涤 3次 ; 加入 50μL 底物 [ 011 mg TMB (四甲基 联苯胺 ) 溶解在 011 mL DM SO 中 , 加入 919 mL , 011 mol/L 乙酸钠 ( pH 值为 610 ) , 过滤 , 再加入 过氧化氢使其最终质量浓度为 0101% ] 37℃作用 30 m in. 加入 50μL 1 mol/L 硫酸终止液 , 阳性孔呈 次黄色 , 于 450 nm 波长测 OD 值. 选择 OD450大于 210的阳性孔进行克隆筛选. 11214 阳性杂交瘤细胞的克隆
72. 1 13. 7
78. 4 15. 4
胰岛素原 1∶3000 73. 9 15. 3
212 胰岛素及胰岛素原单克隆抗体细胞株的建立 来自不同免疫原免疫的鼠脾细胞与 NS21 骨髓
瘤细胞融合后各接种 192 孔. 应用有限稀释法 , 采 用 EL ISA 检测培养物上清的抗体 , 得到细胞的融合 率及阳性孔率 (见表 1). 经过 3 次阳性克隆筛选 , 分别从抗胰岛素的杂交瘤细胞株和抗胰岛素原杂交 瘤细胞株中各挑选出 4株分泌特异性单克隆抗体的
④其他试剂 : 弗氏完全佐剂 ( FCA ) 、弗氏不 完全佐剂 ( F IA ) 、HAT、 PRM I1640均购自 GIBCO2 BRL; PEG4000 (M erck ) ; 胎 牛 血 清 ( Hyclone ) ; Hepes ( Promega) ; 草酰乙酸钠 、丙酮酸钠 、L 2谷 氨酰胺 、牛血清白蛋白组分 V 均购自 AMERSCO; Mouse Typer Kit (B io2Rad) ; FγG (鸡免疫球蛋白 , 中科院上海细胞所提供 ).
胰岛素自交联 : 取 5 mg胰岛素加 500 μL 011 mol/L HC l溶解后加入 500 μL 011 mol/L PB S ( pH 值为 618 ) 混匀 , 再缓慢加入 50wk.baidu.comμL 体积浓度为 1%的戊二醛溶液混匀 , 22～25℃震荡水浴 2 h, 透 析后根据透析液的体积计算抗原的含量.
杂交瘤细胞 (见表 2) , 阳性孔率均达到 100%. 细 胞经过连续传代 3个月仍保持分泌抗体的能力. 按 常规将杂交瘤细胞冻存于液氮中于约半个月 , 然后 进行复苏 , 并采用 EL ISA 检测杂交瘤培养物上清液 的抗体 , 结果表明阳性杂交瘤细胞经冻存复苏后形 态和增殖情况正常 , 抗体分泌能力保持不变 (见表
胰岛素与 FγG交联 : 取 5 mg胰岛素按前方法 溶解. 另取 5 mg FγG加 500μL 011 mol/L PB S (pH 值为 618) 溶解后加入胰岛素溶液中 , 混匀后再慢 慢加入 50 μL 体积浓度为 1%的戊二醛溶液混匀 , 22～25℃震荡水浴 2 h, 透析后根据透析液体积计 算抗原的含量.
3).
表 2 冻存复苏后的阳性克隆细胞株得率和培养液分泌的抗体效价 Table 2 The cloned ra tio of an ti2in sulin and an ti2pro2in sulin hybr idoma s; and the titer in culture m ed ium of resusc ita ted hybr idoma s from liqu id n itrogen
用有限稀释法进行克隆. 用体积浓度为 20%的 胎牛血清和 1 ×HT PRM I1640 培养基稀释活力较好 的抗体阳性孔的细胞为 4个梯度浓度. 每个梯度铺 24个孔 , 每孔 100 μL , 每个培养孔已经预加了 50 μL 来自于腹腔的饲养细胞. 7～10 d开始阳性孔筛 选 , 选择理想的阳性孔细胞重复 3次克隆 , 之后在 体外连续传代 3个月. 11215 抗胰岛素 及 胰 岛 素 原 单 克 隆 抗 体 类 别 和 抗 体特异性的鉴定
关键词 : 胰岛素 ; 胰岛素原 ; 单克隆抗体 中图分类号 : R 392 文献标识码 : A
引 言
叉反应的胰岛素原单克隆抗体 , 并分析了胰岛素单 克隆抗体和胰岛素原单克隆抗体的特异性.
胰岛素的分离及临床应用始于 20 世纪 20 年 代 , 是临床上控制糖尿病 、预防由糖尿病引起的慢 性血管疾病综合症最有效的药物 [ 1 ]. 但是 , 长期使 用异源或不纯的胰岛素会使患者体内产生抗胰岛素 的抗体 , 而抗体又会与胰岛素结合成胰岛素贮库 , 引起延迟的低血糖危险 [ 2 ]. β2细胞分泌的胰岛素原 有 90% ～97%转化为胰岛素 [ 3 ]. 糖尿病临床检测一 直以血糖和尿糖作为指标 [ 4 ] , 忽略了胰岛素贮库和 II型糖尿病人具有部分胰岛素分泌功能等问题 [ 5 ]. 胰岛素单克隆抗体和胰岛素原单克隆抗体的研制成 功为临床监测糖尿病人的胰岛素和胰岛素原水平提 供了重要的手段. 另外 , 临床上的胰岛素药物过敏 一般是由胰岛素不纯引起的 [ 6 ] , 胰岛素单克隆抗体 和胰岛素原单克隆抗体的研制成功也为胰岛素生产 质量控制和高纯度胰岛素制备提供了新的路径. 由 于在免疫剂量下胰岛素会引起动物低血糖死亡 , 目 前尚无胰岛素单克隆抗体研制成功的报道. 本研究 通过交联降低胰岛素生物活性的方法制备了胰岛素 抗原 , 并用杂交瘤细胞技术成功地获得了胰岛素单 克隆抗体 , 但所获得的胰岛素单克隆抗体均与胰岛 素原有交叉反应. 为通过单克隆抗体亲和层析综合 分离高纯度的胰岛素 , 我们又制备了不与胰岛素交
刘士德 , 张建华 , 余少文 , 张维德 , 邢 苗
(深圳大学生命科学学院 , 深圳市微生物基因工程重点实验室 , 深圳 518060)
摘 要 : 应用杂交瘤技术获得针对胰岛素和胰岛素原的各 4 株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞. 其 中 4株分泌胰岛素单克隆抗体的细胞 (N 2I21、N 2I27、N 2I213、N 2I215) 所分泌的抗体亚型均为 IgG1; 分泌 胰岛素原单克隆抗体的细胞株所分泌的抗体亚型分别为 IgA (N 2P I21 ) 、 IgG1 (N 2P I23、N 2P I25 ) 和 IgG2a (N 2P I29) ; 所有抗体的轻链均为 κ型. 所制备的胰岛素原单克隆抗体均不与胰岛素和 C肽交叉反应 , 但所 有胰岛素单克隆抗体均与胰岛素原交叉反应.
1 材料与方法
111 材料 ①纯化的基因重组人胰岛素原及胰岛素 : 由
深圳科兴生物制品有限公司惠赠. 胰岛素 、胰岛素 原和 C肽标准品购自 Sigma公司.
② 8～10周龄的雌性 B alb / c小鼠 , 中科院上海 细胞所提供.
③ NSN I/12AG411骨髓瘤细胞 (简称 NS21, 来 自 P3X63Ag14) , 中科院上海细胞所提供.
2 结 果
211 几种胰岛素免疫原与胰岛素原免疫原的免疫 效果
从 EL ISA 检测的抗胰岛素和胰岛素原的血清效 价可以看出 (见表 1 中鼠抗血清效价 ) , 不同形式 的胰岛素免疫原 , 即颗粒性胰岛素 、自交联胰岛
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深圳大学学报理工版
固相抗原 EL ISA 间接法筛选有杂交瘤克隆生长 的上清 , 酶标结合物为 HRP2羊抗鼠 IgG. 用 0105 mol/L pH 值为 916的 Na2 CO3 2N aHCO3 缓冲液配制 5 μg /mL 的抗原溶液 , 在 PVC96 孔板上 , 每孔加 50 μL抗原溶液 , 室温作用 2 h或 4℃过夜 ; 将抗原吸 出 , 用洗涤液 ( Tris2HC l2Tween缓冲液 0102 mol/L ,
第 22卷 ,第 4期 2005年 10月
深圳大学学报理工版 JOURNAL OF SHENZHEN UN IVERSITY SC IENCE AND ENGINEER ING
Vol122, No14 Oct1 2005
文章编号 : 100022618 (2005) 0420340205
人胰岛素和胰岛素原单克隆抗体制备及分析
胰岛素不 交联 : 取 5 mg 胰 岛 素 加 1 mL 011 mol/L PBS (pH值为 618) 溶解.
胰岛素原 : 取 5 mg胰岛素原加 1 mL 011 mol/L PB S (pH值为 618) 溶解. 11212 小鼠免疫及细胞融合
选取 8～10周龄的 BALB / c小鼠 , 取抗原溶液 加等量 FCA 混合 , 按脚掌 、颈 、背部皮下多点注射 抗原 015 mL /只鼠 (按每只鼠 100μg胰岛素或胰岛 素原 ) , 3周后将等量抗原加 F IA 后进行第二次多 点注射免疫 ; 再过 3 周后腹腔加强免疫等量抗原 ; 一周后取其脾脏进行融合. 采用常规杂交瘤技术取 免疫脾细胞与 NS21骨髓瘤细胞 (10∶1) 在 1 mL 的 促融合剂 ( PEG4000 的质量浓度为 4715% ; DM SO 的质量浓度为 215% ) 中进行融合 , 在加有 5000个 腹腔饲养细胞 /孔的 96 孔板上 , 在 HAT选择培养 液中培养 4 d 后观察细胞的生长情况 , 10 d 后用 EL ISA 方法检测阳性孔. 11213 阳性杂交瘤细胞的检测
应用 “Mouse Typer”Kit (B io2Rad) 测定单克 隆抗体的类别. 以卵白蛋白 (OVA ) 为无关抗原 , 应用 EL ISA 鉴定单克隆抗体类别特异性. 11216 单抗腹水的制备
用降植 烷 ( Pristane ) 作 为 小 鼠 荷 瘤 刺 激 剂 (每只 015 mL ) , 7 d后 , 腹腔内注入 5 ×106 个生长 良好的杂交瘤细胞 , 1～2周后抽吸腹水 ; 继续饲养 重复抽取 2次 , 腹水在 37℃孵育 1 h后 , 4℃过夜 , 次日 3000 g离心 10 m in, 上清即为含单克隆抗体的 腹水. 11217 单抗腹水抗体效价测定
⑤HAT选择培养液 : 20%胎牛血清 , 1 ×HAT, 基础培养基用 PRM I1640. 112 方 法 11211 抗原的制备
胰岛素与 B SA 交联 : 取 5 mg胰岛素加 400 μL
收稿日期 : 2005208218 基金项目 : 深圳市科研基金资助项目 (199908) 作者简介 : 刘士德 (19622) , 男 (汉族 ) , 吉林省公主岭市人 , 深圳大学副教授 、博士. E2mail: liusd@ szu1edu1cn
第 4期
刘士德 , 张建华 , 等 : 人胰岛素和胰岛素原单克隆抗体制备及分析
341
011 mol/L HC l溶解 , 再加 3 μL 2 mol/L NaOH 调 pH 值 , 浑浊现象摇后消失 , 再加 100μL 011 mol/L PB S (pH 值为 618 ) 混匀. 另取 5 m g B SA 加 500 μL 011 mol/L PB S (pH 值为 618) 溶解后与胰岛素 溶解液混匀 , 再加 50 μL 体积浓度为 1%的戊二醛 溶液混匀 , 22 ～25℃震荡水浴 2 h, 透析后根据透 析液的体积计算抗原的含量.
第 22卷
素 、胰岛素 - FγG、胰岛素 - BSA 和胰岛素原免疫 原 , 均可以获得有效的免疫 , 其中以自交联的胰岛
素免疫的抗血清效价最高 , 而颗粒性胰岛素免疫容 易导致小鼠低血糖死亡.
免疫原 鼠抗血清效价 融合率 / % 阳性孔率 / %
表 1 胰岛素及胰岛素原的免疫效果及单克隆抗体细胞株的建立 Table 1 The imm unoreaction of in sulin an tigen s and pro2in sulin,
the ra tio of cloned hybr idoma s wells and the ra tio of excreting an tibody wells
颗粒性胰岛素
自交联胰岛素
胰岛素 - FγG
胰岛素 - BSA
1∶1000
1∶4000
1∶2000
1∶2000
67. 8 15. 6
74. 5 16. 6
pH 值为 712) 洗涤 2次 ; 每孔加质量浓度为 3%的 B SA 100μL , 室温作用 2 h, 洗涤 2次 ; 加入 50μL 杂交瘤培养上清 , 室温作用 1 h, 洗涤 2 次 ; 每孔 加入 1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG 质量浓度为 3%的 B SA / PB S 50 μL , 室温作用 1 h, 洗涤 3次 ; 加入 50μL 底物 [ 011 mg TMB (四甲基 联苯胺 ) 溶解在 011 mL DM SO 中 , 加入 919 mL , 011 mol/L 乙酸钠 ( pH 值为 610 ) , 过滤 , 再加入 过氧化氢使其最终质量浓度为 0101% ] 37℃作用 30 m in. 加入 50μL 1 mol/L 硫酸终止液 , 阳性孔呈 次黄色 , 于 450 nm 波长测 OD 值. 选择 OD450大于 210的阳性孔进行克隆筛选. 11214 阳性杂交瘤细胞的克隆
72. 1 13. 7
78. 4 15. 4
胰岛素原 1∶3000 73. 9 15. 3
212 胰岛素及胰岛素原单克隆抗体细胞株的建立 来自不同免疫原免疫的鼠脾细胞与 NS21 骨髓
瘤细胞融合后各接种 192 孔. 应用有限稀释法 , 采 用 EL ISA 检测培养物上清的抗体 , 得到细胞的融合 率及阳性孔率 (见表 1). 经过 3 次阳性克隆筛选 , 分别从抗胰岛素的杂交瘤细胞株和抗胰岛素原杂交 瘤细胞株中各挑选出 4株分泌特异性单克隆抗体的
④其他试剂 : 弗氏完全佐剂 ( FCA ) 、弗氏不 完全佐剂 ( F IA ) 、HAT、 PRM I1640均购自 GIBCO2 BRL; PEG4000 (M erck ) ; 胎 牛 血 清 ( Hyclone ) ; Hepes ( Promega) ; 草酰乙酸钠 、丙酮酸钠 、L 2谷 氨酰胺 、牛血清白蛋白组分 V 均购自 AMERSCO; Mouse Typer Kit (B io2Rad) ; FγG (鸡免疫球蛋白 , 中科院上海细胞所提供 ).
胰岛素自交联 : 取 5 mg胰岛素加 500 μL 011 mol/L HC l溶解后加入 500 μL 011 mol/L PB S ( pH 值为 618 ) 混匀 , 再缓慢加入 50wk.baidu.comμL 体积浓度为 1%的戊二醛溶液混匀 , 22～25℃震荡水浴 2 h, 透 析后根据透析液的体积计算抗原的含量.
杂交瘤细胞 (见表 2) , 阳性孔率均达到 100%. 细 胞经过连续传代 3个月仍保持分泌抗体的能力. 按 常规将杂交瘤细胞冻存于液氮中于约半个月 , 然后 进行复苏 , 并采用 EL ISA 检测杂交瘤培养物上清液 的抗体 , 结果表明阳性杂交瘤细胞经冻存复苏后形 态和增殖情况正常 , 抗体分泌能力保持不变 (见表
胰岛素与 FγG交联 : 取 5 mg胰岛素按前方法 溶解. 另取 5 mg FγG加 500μL 011 mol/L PB S (pH 值为 618) 溶解后加入胰岛素溶液中 , 混匀后再慢 慢加入 50 μL 体积浓度为 1%的戊二醛溶液混匀 , 22～25℃震荡水浴 2 h, 透析后根据透析液体积计 算抗原的含量.
3).
表 2 冻存复苏后的阳性克隆细胞株得率和培养液分泌的抗体效价 Table 2 The cloned ra tio of an ti2in sulin and an ti2pro2in sulin hybr idoma s; and the titer in culture m ed ium of resusc ita ted hybr idoma s from liqu id n itrogen
用有限稀释法进行克隆. 用体积浓度为 20%的 胎牛血清和 1 ×HT PRM I1640 培养基稀释活力较好 的抗体阳性孔的细胞为 4个梯度浓度. 每个梯度铺 24个孔 , 每孔 100 μL , 每个培养孔已经预加了 50 μL 来自于腹腔的饲养细胞. 7～10 d开始阳性孔筛 选 , 选择理想的阳性孔细胞重复 3次克隆 , 之后在 体外连续传代 3个月. 11215 抗胰岛素 及 胰 岛 素 原 单 克 隆 抗 体 类 别 和 抗 体特异性的鉴定
关键词 : 胰岛素 ; 胰岛素原 ; 单克隆抗体 中图分类号 : R 392 文献标识码 : A
引 言
叉反应的胰岛素原单克隆抗体 , 并分析了胰岛素单 克隆抗体和胰岛素原单克隆抗体的特异性.
胰岛素的分离及临床应用始于 20 世纪 20 年 代 , 是临床上控制糖尿病 、预防由糖尿病引起的慢 性血管疾病综合症最有效的药物 [ 1 ]. 但是 , 长期使 用异源或不纯的胰岛素会使患者体内产生抗胰岛素 的抗体 , 而抗体又会与胰岛素结合成胰岛素贮库 , 引起延迟的低血糖危险 [ 2 ]. β2细胞分泌的胰岛素原 有 90% ～97%转化为胰岛素 [ 3 ]. 糖尿病临床检测一 直以血糖和尿糖作为指标 [ 4 ] , 忽略了胰岛素贮库和 II型糖尿病人具有部分胰岛素分泌功能等问题 [ 5 ]. 胰岛素单克隆抗体和胰岛素原单克隆抗体的研制成 功为临床监测糖尿病人的胰岛素和胰岛素原水平提 供了重要的手段. 另外 , 临床上的胰岛素药物过敏 一般是由胰岛素不纯引起的 [ 6 ] , 胰岛素单克隆抗体 和胰岛素原单克隆抗体的研制成功也为胰岛素生产 质量控制和高纯度胰岛素制备提供了新的路径. 由 于在免疫剂量下胰岛素会引起动物低血糖死亡 , 目 前尚无胰岛素单克隆抗体研制成功的报道. 本研究 通过交联降低胰岛素生物活性的方法制备了胰岛素 抗原 , 并用杂交瘤细胞技术成功地获得了胰岛素单 克隆抗体 , 但所获得的胰岛素单克隆抗体均与胰岛 素原有交叉反应. 为通过单克隆抗体亲和层析综合 分离高纯度的胰岛素 , 我们又制备了不与胰岛素交
刘士德 , 张建华 , 余少文 , 张维德 , 邢 苗
(深圳大学生命科学学院 , 深圳市微生物基因工程重点实验室 , 深圳 518060)
摘 要 : 应用杂交瘤技术获得针对胰岛素和胰岛素原的各 4 株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞. 其 中 4株分泌胰岛素单克隆抗体的细胞 (N 2I21、N 2I27、N 2I213、N 2I215) 所分泌的抗体亚型均为 IgG1; 分泌 胰岛素原单克隆抗体的细胞株所分泌的抗体亚型分别为 IgA (N 2P I21 ) 、 IgG1 (N 2P I23、N 2P I25 ) 和 IgG2a (N 2P I29) ; 所有抗体的轻链均为 κ型. 所制备的胰岛素原单克隆抗体均不与胰岛素和 C肽交叉反应 , 但所 有胰岛素单克隆抗体均与胰岛素原交叉反应.
1 材料与方法
111 材料 ①纯化的基因重组人胰岛素原及胰岛素 : 由
深圳科兴生物制品有限公司惠赠. 胰岛素 、胰岛素 原和 C肽标准品购自 Sigma公司.
② 8～10周龄的雌性 B alb / c小鼠 , 中科院上海 细胞所提供.
③ NSN I/12AG411骨髓瘤细胞 (简称 NS21, 来 自 P3X63Ag14) , 中科院上海细胞所提供.