放射性配体与受体结合分析实验(RBA)方法

• 组织匀浆机 • IKA，T10B S25
• 源自文库涡混合器 • WH-2
• 低温高速离心机 • 凯达，TGL20M
• 超低温冰箱 • 海尔
• 数显恒温水浴锅 • 金燕，HH-S26S
• 制冰机 • GELIN • 型号IMS-50 automatic ice flakes
电热恒温水温箱
• 循环水式多用真空泵
CaCl2、MgCl2 、DMSO 、甲苯、PPO 、POPOP、Methysergide 、 Butaclamol及5HT 等
2、制备膜受体
• 大鼠断头取脑 • 分离出目标组织 • 加10倍体积（V / W）冰冷的缓冲液 • 用组织匀浆机匀浆3次，每次数秒钟，制成组织匀浆液 • 组织匀浆液用低温高超离心机离心（12000转/分）3次，每次20分钟 • 弃上清液，沉淀（膜受体）放-80度超低温冰箱保存备用 • 注意：该项操作所需试剂或仪器 • 仪器：手术器械、组织匀浆机、制冰机、超低温冰箱、低温高超离心机 • 试剂：超纯水
• 注意：该项操作所需试剂或仪器 • 仪器：移液枪、烧杯、量筒、EP管等 • 试剂：超纯水、无水乙醇、放射性配体母液
4、 受体配体结合反应
• 以上各管在加完放射性配体后，立即放入37度的水浴锅中，孵育20 分钟。20分钟后把各管放入冰中终止反应。
• 注意：该项操作所需试剂或仪器 • 仪器：恒温水浴锅，制冰机 • 试剂：无
receptors），它是应用放射性核素标记配基与特异受体相结合，研 究受体的亲和力和受体的数量，以及研究受体亚型的常用方法。 • 原理 • 放射性标记配基（激动剂或拮抗剂）和组织、细胞，或含有受体的 制剂一起温育，使受体和配基充分结合，形成受体-配基复合物，终 止反应后，用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测定滤膜 或沉淀物中的放射性，即可计算出和配基结合的受体的量。
实验方法流程
实验方法流程
1、制备受体样品； 2、加样、温育进行结合反应； 3、终止反应，分离结合物与游离物 4、测定结合物的放射性； 5、数据处理。
实验具体操作（D1、D2、5-HT）
• 1、配制各种缓冲液及试剂 • 按处方配比配制各种缓冲液贮备液 • 配制各种非标记配体溶液 • 配制各种受试药物溶液 • 注意：该项操作所需试剂或仪器 • 仪器：分析天平、移液枪、烧杯、量筒、容量瓶、试管、EP管等 • 试剂：无水乙醇、超纯水、Tris 、抗血酸、优降宁、HCl 、NaCl、KCl、
• 液闪测定计数仪 • HIDEX， 425-034型
实验材料
• 2ml离心管 • 6ml一次性软试管
枪头
1ml
200ul 10ul
• Tris • PPO与POPOP
过滤装置
• 砂芯过滤装置（抽滤瓶） • 1000ml
• Whatman GF/C玻璃微纤维滤纸 • 40mm
放射性化合物
• 放射性配体 • 低温保存
药理室讲座
放射性配体与受体结合分析实验（RBA） 方法
刘星华 2011-5-13
内容
• 实验定义与原理 • 实验材料与仪器 • 实验方法 • Scatchard方程与作图（饱和与竞争实验） • RBA的安全问题 • 实验举例
实验定义与原理
• 定义 • 放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析（radioassay of
6、 测定结合型放射配体每分钟放射计数
• 采用放射性计数仪，测定各测试管中结合型放射配体每分钟放射计 数
• 注意：该项操作所需试剂或仪器 • 仪器： 液闪仪 • 试剂： 无
7、数据处理
• 按以下公式计算各化合物对同位素配基结合的抑制率百分率：
• 抑制率(I %)=（总结合管cpm—化合物cpm）/ （总结合管cpm—非特异结合管cpm）×100%
Scatchard方程与作图
• 简单单位点系统受体和配体结合反应（Clark模型）条件： • （1）配基与受体结合反应为可逆双分子反应； • （2）所有受体都是等效和独立的，同一受体的不同分子对配基的亲和
RBA的分类
RBA用放射性核素来标记配基，与相应的受体进行特异性结合反 应，可对受体的性质进行定性和定量的分析。 • 1、定性RBA：是通过反应的量效关系的变化来判断受体的类型， 单位点或多位点结合式，及受体与配体结合的特点，反应的可逆性、 协作性等。 • 2、定量RBA：是在已知配体与受体反应性质的基础上，通过结 合反应，给出一定量的组织或细胞中能与该放射性配体结合的受体 数及结合的平衡解离常数或结合位点数（最大结合容量）。
3、加样
• 取出膜受体，加入一定体积的冰冷的缓冲液，混匀，使成一定浓度的膜受体溶液。 • 取放射性配体母液，用无水乙醇稀释成实验所需浓度 • 按以下顺序及比例加入各种反应液。
• （1）总结合管：100ul膜受体 + 200ul缓冲液 + 10 ul 放射性配体 • （2）非特异管：100ul膜受体 + 100ul缓冲液 + 100ul非标记配体 + 10 ul 放射性配体 • （3）受试物管：100ul膜受体 + 100ul缓冲液 + 100ul药物溶液 + 10 ul 放射性配体
• 化合物每次实验做两复管，进行两次单独实验。
8、各种指标
• IC50：半数抑制浓度 • KD：平衡解离常数（mol/L），物理意义为受体有一半结合配基时所
需要的配基浓度。 • Bmax：受体最大结合容量（fmol /mg蛋白质） • nH：Hill系数
Scatchard方程与作图 （饱和实验）
5 、分离游离及结合的放射性配体
• 上述各管在反应结束后，分别倒入抽滤装置进行过滤，并用5-10ml 冰冷的缓冲液冲洗滤膜2次。滤膜放入85度烘箱中烘干，随后放入测 试管中，关加入一定体积的闪烁液，浸泡过夜。
• 注意：该项操作所需试剂或仪器 • 仪器： 抽滤器、烘箱、滤纸、移液枪、液闪杯 • 试剂： 甲苯、PPO 、POPOP
实验材料与仪器
实验材料
• 动物组织（皮层、海马、纹状体等） • 仪器（组织匀浆机、旋涡混合器、低温高速离心机、电热恒温水温
箱、-80℃冰箱、制冰机、抽虑瓶、液闪仪等） • 材料（ 2ml/6ml分离管、10ul/200ul/1ml枪头、微纤维滤纸等） • 药品（放射性配基、各种非标计化合物等）
实验仪器