实验七 叶绿体色素的提取分离及理化性质的鉴定讲课讲稿

实验七叶绿体色素的提取分离及理化性质

的鉴定

实验七叶绿体色素的提取及理化性质的鉴定

一、目的

1、学习应用提取分离叶绿体色素的实验方法。

2、验证叶绿素的理化性质。

3、了解叶绿体色素的荧光现象、皂化反应等理化性质。

二、原理

1、叶绿体色素：植物叶绿体色素主要有三类：1）叶绿素 2）类胡萝卜素 3）藻胆素。高等植物叶绿体中含有前两类，藻胆素仅存在于藻类植物中。

高等植物体内叶绿素（chlorophyll两种）主要有两种：叶绿素a、b（简写为chla、chlb，其结构式见图7-3），chla通常呈蓝绿色，而chlb呈黄绿色，chlb 是chla局部氧化的衍生物。chla是chlb的三倍，二十世纪30年代，知道了叶绿素的分子结构，50年代末期，人工合成了叶绿素a，其它色素也几乎在同时发现。

叶绿体中的类胡萝卜素主要包括胡萝卜素（carotene）和叶黄素（lutein）两种，前者呈橙黄色，后者呈黄色。叶黄素是胡萝卜素的二倍。一般植物叶绿素是类胡萝卜素的三到四倍；

胡萝卜素：C40H56 （有α、β、γ三种同分异构体）

叶黄素： C40H54（OH）2 (同分异构体很多)。

2、理化性质：这二大类四种色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，如乙醇、丙酮等。通常用80%的丙酮或丙酮：乙醇：水为4.5：4.5：1的混合液来提取叶绿素。

按化学性质来说，叶绿素是叶绿酸的酯，在碱的作用下，可使其酯键发生皂化作用，生成叶绿酸的盐，能溶于水，但由于它保留有Mg核的结构，仍保持原来的绿色。而类胡萝卜素中，胡萝卜素是不饱和的碳氢化合物，β—胡萝卜素水解可生成2分子维生素A，叶黄素是由胡萝卜素衍生的二元醇，不能与碱发生皂化反应，根据这一点，可以将叶绿素和类胡萝卜素分开。此外，叶绿素还可以在酸的作用下，其中的Mg被H所代替形成褐色的去Mg叶绿素：去Mg叶绿素能与其他金属盐中的铜、锌、铁盐等代H，又重新呈现绿色，比原来的绿色更稳定。根据这一原理可用醋酸铜处理来保存绿色标本。

3、功能：

1．叶绿体色素的功能

叶绿素和类胡萝卜素都包埋在类囊体膜中，与蛋白质结合在一起，组成色素蛋白复合体，根据功能来区分，叶绿体色素可分为二类：

（1）作用中心色素：叶绿素分子含有一个卟啉环的“头部”和一个叶绿醇的“尾部”，呈蝌蚪型，大卟啉环由四个小吡咯环以四个含有双键的甲烯基（-CH=）连接而成。镁原子居于卟啉环的中央，偏向于带正电荷，与其相联的氮原子则偏向于带负电荷，因而其“头部”具有极性，是亲水的，可以与膜上的蛋白质结合；而其“尾部”是叶绿酸的双羧基被甲醇和叶醇所酯化后形成的脂肪链，具疏水亲脂性，可以与膜上的双卵磷脂层结合，因此，这决定了叶绿素分子在类囊体膜上是有规则的定向排列。极少数具特殊状态的chla分子，其卟啉环上的共轭双键易被光激发而使电子与电荷分离，引起光能转化为电能的重要反应，因此这些chla分子是光合作用的重要色素，称“作用中心色素”；

（2）天线色素（聚光色素）：没有光化学活性，只有收集光能的作用，包括大部分chla 和全部chlb、胡萝卜素、叶黄素。这些色素排列在一起，象漏斗一样，把光传递集中到作用中心色素，引起光化学反应。类胡萝卜素还是一种保护性色素，在光过强时，可耗散过剩激发能，消除活性氧自由基，防止光合器官被氧化损伤。

3、形成条件：

叶绿素的形成

叶绿素在植物体内，能不断的进行新陈代谢，如菠菜的叶绿素72小时更新95.8%；烟草19天后更新50%，其合成与分解受植物遗传控制（如吊兰叶的白边），也与环境关系密切。

高等植物的叶绿素形成可以分为两个阶段，第一个阶段：主要是由α-酮戊二酸（或由其和氨形成的谷氨酸）经过一系列复杂的生化反应合成叶绿素的前身物质—无色的原叶绿酯；第二个阶段：原叶绿酯在光下被还原，成为绿色的叶绿素。

叶绿素形成的条件

1．光照光是叶绿素形成的必要条件，原叶绿素必须经过光照后才能合成叶绿素。缺乏光照或其他某些条件，影响叶绿素形成，使叶子发黄的现象，称黄化现象。由于黄化部位，机械组织不发达，肉质细嫩，生产上常用于遮光培育韭黄、蒜黄、葱白等；而光太强对叶绿素也不利，会使叶绿素氧化、褪色、去镁，并形成对膜有害的自由基。

有些植物或植物部分无光照条件也能形成叶绿素，如松、柏，莲子胚芽等，推测这些植物中含有代替可见光促进叶绿素合成的物质。

2．温度温度主要通过影响叶绿素合成酶的活性而影响叶绿素的合成。一般叶绿素形成的最低温度为2～4℃，最适26-30℃左右，最高约40℃。早春植物幼芽、叶呈黄绿色，是低温影响了叶绿素的形成的缘故。

3．矿质营养矿质元素对叶绿素形成也有很大影响。N和Mg是叶绿素的组成成分，Fe、Mn、Cu、Zn等在叶绿素合成过程中也是必不可缺少的元素，缺少这些元素会引起缺绿症。特别是氮素，植株体内氮水平高低可影响叶绿色的深浅，生产上以此来判断氮肥的丰缺。

4．水分和氧气植物缺乏水和O2，不仅抑制叶绿素的形成，还会促进原有叶绿素的分解。所以严重高温、干旱缺水和涝害缺O2时，叶子常表现黄色褪绿现象。

由于叶绿素的形成受许多条件的影响，所以叶色是反映植物的营养情况和健康状况的一个很灵敏的指标，成为肥水管理和调控作物生长发育的依据之一。5、提取：叶绿体色素为有机酯类化合物，根据相似相容原理，常用有机溶剂提取。如酒精、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等。

分离：薄层层析法是将吸附剂均匀的涂抹在玻璃板上形成一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待测分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂作流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂中。流动相通过毛细管作用由下而上逐渐浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组成分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、脱吸附、再吸附……的过程。由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附能力强的物质相对移动慢一些，儿媳妇能力弱的物质相对移动快一些，从而使各组分有不同移动速度而彼此分开。