脂肪酶活检测原理及方法

脂肪酶活检测原理及实际方法：
一、原理以及标准曲线做法
1.对硝基苯酚酯（4-Nitrophenyl ester）是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种
底物，脂肪酶水解其产生pNP（对硝基苯酚）在碱性条件下显黄色，在410nm下有吸光值，且灵敏度很高。

2.所需试剂有：
CAS 碳链长度出货号价格名称
830-03-5 C2 N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G ￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C8 21742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8 C18 N3627-1G ￥2621.97 对硝基苯硬酸脂
全部为色谱纯试剂，购于sigma公司
3.标准曲线绘制：
a.标准对硝基苯酚母液(2mM，2mmol / L):
称取0.02789g的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml的溶液B（即不同pH的缓冲液），置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。

方法一：
b.标准曲线绘制：
分别取0.02，0.04，0.06，0.08，0.12，0.16ml的对硝基苯酚母液(2mM)，用溶液B（即不同pH的缓冲液）稀释至4ml，分别测定在410nm处的吸收值。

以对硝基苯酚浓度x（对应浓度分别是0.01，0.02，0.03，0.04，0.06，0.08，单位：mM）为横坐标，吸光值y为纵坐标，绘制标准曲线。

方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。

b.标准曲线的绘制：
分别取0、1.875、3.75、7.5、15、22.5、30、45μL的对硝基苯酚分别加入62.5、60.625、58.75、55、47.5、40、32.5、17.5μL的异丙醇和（全部都是）562.5的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min，3min，测出标准曲线。

上表是方法一测得标准曲线
脂肪酶酶活定义：在410nm下测定吸光值,以1 min内催化水解底物对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)产生1μmol对硝基苯酸(p-NP)所需的酶量为1个酶活单位(U)。

公式y=14.474x+0.0272中x是p-NP的浓度(单位：mmol/l)，y是吸光值，14.474、0.0272是反应系数，R2是相关系数。

则，酶活计算公式为：
酶活=1000*n*V*(y-0.0272) / 14.474t 其中n为稀释倍数，t为反应时间（单位：min），V 为反应体系的总体积（单位：L）、1000是mmol到μmol的比例。

二、底物耐碱性测定及试验液配制
1.底物耐碱性测定
a.6种底物分别加至pH7，pH8的37℃的PBS缓冲液中（选择37℃培养箱），每隔5min检测一次颜色变化，拍照；
b.6种底物分别加至pH8，pH9的Tris-HCl缓冲液中（37℃），每隔5min检测一次颜色变化，拍照；
c.分别加至pH9，pH10的Gly-NaOH缓冲液。

2.测酶活所需要试剂的配制，酶活测定方法
方法一：（96孔板法，粗略，速度快）
a.溶液的配制
溶液A：溶液A:30.0mg对硝基苯棕桐酸脂(p-NPP，Sigma，或者其他底物，337.52g/mol，即8.89*10-5mol)溶于10.00ml异丙醇（浓度为8.89*10-3M，或8.89mM），4℃棕色瓶（可以使用包锡箔纸的15ml离心管）保存，每10ml可用于单个酶500次测定；
溶液B:缓冲液(pH缓冲液，可更改)100.0ml加入1滴TritonX-100，混匀，4℃保存。

96孔板（220μL）：
A液（底物液）：18μL
↗
体系液180（μL）+ 酶液（40μL）
↘
B液（pH缓冲液）：162μL
此步骤中，底物再次被稀释，浓度为0.889mM。

方法二：（吸光度法，精准，速度慢）
a.溶液的配制
溶液A:30.0mg对硝基苯棕桐酸脂(p-NPP，Sigma，或者其他底物)溶于10.00ml异丙醇，4℃棕色瓶（可以使用包锡箔纸的15ml离心管）保存，每10ml可用于单个酶8-10次测定，或用于8-10个酶一次测定，或用于一个酶4次密精测定；
溶液B:缓冲液(pH缓冲液，可更改)100.0ml加入1滴TritonX-100，混匀，4℃保存。

b.脂肪酶的活力测定（以单个酶液做一个/ 两个对照为例）
①准备试管30个，10个15ml离心管；
②取1ml / 1.2ml溶液A加入到9ml / 10.8ml溶液B于离心管中，充分混匀，37℃水浴保温5min，分装至3 / 4个试管中，每个2.7ml，即体系液；
③向每个试管中加入适量酶液（粗酶液加300μL），对照组中加入灭活酶液(沸水煮沸5min)，加入酶液后即为反应液；
④37℃反应10-15min，加入95%乙醇终止反应，在410nm下测定吸光值，每个样品重复2 / 3次，取平均值。

三、96孔板装样方式：
步骤一：温度不变，定为40℃，以pH和底物为变量，先在EP管内反应，后加入至96孔板中。

其中每个孔是220μL体系。

pH缓冲液分别采取PBS缓冲液（7、8）、Tris-HCl缓冲液（8、9）。

a.该方法需要的总酶液量（每个酶的单次实验）：40*80=3.2ml，其中需要灭活的是800μL。

以方便计算以及加样，取4ml酶液，1ml用来灭活。

b.该方法需要的单个底物的总量是（每个酶的单次试验）：18*16=288μL，以方便计算和加样，取300μL。

c.以三个酶为例仅做pH和底物交叉实验为例，需要每个酶液4ml，每个底物900μL。

表为96孔加样模式：C2等代表底物，后面的数字代表pH，红色字体表示一个空白对照和
三个平行。

蓝色字体中，pH8分别用了PBS缓冲液和Tris-HCl缓冲液，以便比较不同缓冲液对酶活的影响。

步骤二：pH不变，以温度和底物为变量，先在EP管内反应，后加至96孔板中。

其中每个孔是220μL体系。

a.该方法需要的总酶液量（每个酶的单次实验）：40*60=2.4ml，其中需要灭活的是600μL。

以方便计算以及加样，取3ml酶液，750ml用来灭活。

b.该方法需要的单个底物的总量是（每个酶的单次试验）：18*12=216μL，以方便计算和加样，取250μL。

c.以三个酶为例仅做pH和底物交叉实验为例，需要每个酶液3ml，每个底物750μL。

表为96孔加样模式其中C2等代表底物，后面的数字代表温度，红色字体表示一个空白对照和三个平行。

40℃因已经在上个步骤中做过，不再重复。