第四章 核酸电泳

影响RNA提取的因素
材料：
新鲜，切忌使用反复冻融的材料 如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料 贮存在TRIzol或样品贮存液中，于－70℃或－20℃保存 如要多次提取，请分成多份保存

液氮长期保存，－70℃短期保存
影响RNA提取的因素
样品破碎及裂解：
根据不同材料选择不同的处理方法： 培养细胞：通常可直接加裂解液裂解 酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先 用酶或者机械方法破壁
1. 在Trizol试剂的保护下，匀浆组织，静置裂解细胞释放 内含RNA，Trizol试剂对RNA有保护作用，能抑制RNA 酶的活性，并且同时有裂解细胞的作用。 2.将匀浆液中加入苯酚，去除裂解液中的脂类，蛋白和 DNA，离心后取出上清液，里面含有RNA，而杂志留在 苯酚中。
3.在上清液中加入等体积异丙酮，混匀后，静置片刻，离 心，将RNA沉淀于管底。弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀， 离心。去上清，将沉淀在真空干燥器中烘干。
系中的中间相和水相，从而得以分离；
• 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。
RNA提取的通用方法
异硫氰酸胍/苯酚法
• • • • • 步骤:
材料准备：尽量新鲜。 裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。 使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。 纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。 洗涤：70％乙醇。 沉淀：异丙醇、无水乙醇。 乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。 此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳
3.脉冲电泳凝胶电泳
1.琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖
是一种从红色海藻产物琼脂中提取而来的线性多糖聚合物。当琼脂糖加 热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质．琼脂糖由1,3连接的吡喃型βD-半乳糖与1,4连接的3,6脱水吡喃型α-L-半乳糖组成。 琼脂糖分子呈随机线团状，凝结初期由于氢键的作用形成双链分子，而后 再发生双链分子间的连接直至最后固化。由于链间的连接是靠氢键的作用， 所以一切会破坏氢键形成的因素都会影响凝胶的形成。
根据琼脂糖的溶解温度， 把琼脂 糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂 糖.低熔点琼脂糖熔点为62～65℃， 溶解后在 37℃下维持液体状态约 数小时，主要用于DNA片段的回 收，质粒与外源性DNA的快速连 接等.
凝胶的分辨能力
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小． 浓度越高，孔隙越小．其分辨能力也就越强：
3.DNA的浓缩
(1)乙醇 (2)异丙醇
(3)聚乙二醇(PEG600)
工作区域应与进行普通微生物实验的区域分离好
RNA的提取分离
RNA提取的通用方法
异硫氰酸胍/苯酚法

•
原理：
细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变 性，核酸释放；
•
释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体
引物和模板的非特异性退火
基因特异性引物设计较差 RNA中有基因组DNA的污染 形成引物二聚体 镁离子浓度太高
解决方案
提高反应的温度和特异性
提高引物的特异性 使用扩增级DNaseⅠ处理RNA 设计在3'端没有互补序列的引物 优化镁离子浓度
RT常见问题分析和解决方案
问题三：产生弥散（smear）条带 可能原因
75% 乙醇洗涤
样品中杂质的残留
多糖等杂质，再次沉淀
DNA 污染
使用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA
RT常见问题分析和解决方案
问题一：少量或没有RT-PCR产物 可能原因
RNA降解 RNA中含逆转录酶抑制剂 起始RNA量太低
解决方案
分离无污染，高质量的RNA；防止RNA降解 70％（v/v）乙醇清洗RNA沉淀，除去抑制剂 增加RNA的量 用氯化锂沉淀RNA以除去多糖
RNA提取常见问题
RNA 的降解 OD260 /OD280 比值偏低
电泳带型异常
下游实验效果不佳
新鲜细胞或组织：
裂解液的质量
外源RNase的污染 裂解液的用量不足 组织裂解不充分 另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏，胸腺等)，很
RNA降解
难避免 RNA 的降解。
凝胶电泳的原理：
当一种分于被放置在电场当中时、它们就会以一定的速度移向适当的电极。 这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率。
它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。 也就是说电场强度越大电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度也 就越快。反之则较慢。
电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。
1）紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。 如计算DNA浓度
A260×稀释倍数×50＝ μg/ml
(A值等于1时，相当于50μg/ml双链DNA， 40μg/ml单链DNA或RNA， 20μg/ml单链寡核苷酸）
紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。
各种碱基的紫外吸收光谱
核酸电泳
前期准备:
1.应与进行普通微生物实验的区域分离好 2.使用标有“无RNA酶”的商品试管,吸头,溶液和水.通常 新的无菌处理过的塑料试管和吸管无RNA酶 3.双蒸水(ddH2O)和溶液应该用RNA酶的抑制剂DEPC(焦 碳酸二乙酯)进行处理:每100mL溶液或水中加入0.1mL DEPC原液,放在摇床上充分混匀并在37℃下作用数小时.然 后将溶液高压灭菌15min使DEPC失活 4.分离RNA以前,将一些实验室玻璃制品置于烤箱在300 ℃ 烘烤4h以灭活核酶.如有可能,将其他设备也灭菌处理
第一链产物的含量过高
解决方案
常规PCR步骤中减少第一链产物的量
PCR反应中引物过多
循环数过多 退火温度过低
减少引物的用量
减少PCR的循环次数 提高退火温度
寡核苷酸片段产生的非特异性扩增
提取高质量RNA，防止被DNA污染
4、DNA鉴定
DNA的鉴定
浓度鉴定
纯度Leabharlann Baidu定
完整性鉴定
浓度鉴定
核酸物质提取与电泳
天然DNA的制备
一般地说。总DNA主要是指基因组 DNA(genomic DNA)，即细胞核内的染色体 DNA分子。核DNA分子呈极不对称的线状 结构．一条染色体为一个DNA分子。高等 植物核DNA大约含有106 bp,其长度与直径 的比例极不对称．使其对机械力十分敏感。 虽然目前可以成功地测定出它的一级结构。 但仍难以分离出它的完整分子。
OD260 /OD280 比值偏低
抽提试剂残留：
确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75% 乙醇。

解决办法:再沉淀一次后，溶解。
设备限制：
测定OD260 及OD280 数值时，要使OD260 读数在 0.10 - 0.50
之间。此范围线性最好。
用水稀释样品：
测 OD 时，对照及样品稀释液请使用 10 mM Tris，pH 7.5。用 水作为稀释液将导致比值的降低。
低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值
表明有RNA的残留量。
A260与A280之比应在1.80；纯的RNA A260与A280之比应
在2.0。
A260/A280比值是纯度检测的重要指标。
完整性鉴定
凝胶电泳法：
基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出 现电泳图谱脱尾现象；
总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNA降解； 如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。
核酸电泳
带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳 (electrophoresis)。 各种生物大分子在一定pH条件下．可以解离成带电荷 的离子。在电场中会向相反的电极移动。 人们采用各种材料作为支持电泳介质．创造出许多新方 法．其中以琼脂糖和聚丙烯酰胺为支持介质的凝胶电泳 最为突出。
自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以 来．按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术．已经发 展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相 互作用的重要实验手段．
1.天然DNA的来源 (1)染色体DNA (2)病毒与噬菌体 (3)质粒DNA (4)线粒体与叶绿体
2.DNA的提取 细胞的破碎
破碎的手段： 物理方式：超声波法、匀浆法、液氮破碎法: 容易导致DNA链的断裂 . 对于细胞破碎较困难的植物材料，可以辅加蛋白酶 K，在酶的存在下共同破碎细胞。
超生波
液氮
蛋白质及其它杂质的去除
SDS使蛋白形成不溶物，沉淀出来 高浓度盐离子(KCl)使变性蛋白、多糖、细胞碎屑等沉淀出来
细菌线形染色体DNA的去除
强热、碱处理时，细菌线性染色体DNA变性，当快速降温、加入 酸中和时，已变性的细菌线性染色体DNA变性不能快速复性，与 其它杂质缠绕而沉淀出来 质粒DNA双链可快速恢复原状,重新形成超螺旋分子,并以溶解状态 存在于液相中。
总DNA的提取方法：
去除多糖、脂类、蛋白等，得到的就是核酸
去除多糖：CTAB、PVP、高盐溶液等 去除脂类：SDS、CTAB等 去除蛋白：SDS、蛋白酶Ｋ、酚／氯仿等
DNA RNA
质粒DNA的提取
破坏细胞壁 裂解细胞膜
溶菌酶、强碱和十二烷基磺酸钠(SDS) 十二烷基磺酸钠(SDS) 、Triton X-100
浓度降低．孔隙就增大．其分辨力也就随之减弱。
凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关。琼脂糖凝胶分辨DNA片段 的范围为70bp-80kb之间；而要分辨较小分子旦的DNA片段，则要用聚 丙烯酰胺凝胶，其分辨能力为6-1000bp之间。
多糖同RNA共沉淀
合成cDNA第一链合成的引 确定退火温度适合所用的引物 物退火失败
RNA模板存在较多二级结 构 反转录成功，PCR失败
将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退 火，提高逆转录反应温度 PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物
RT常见问题分析和解决方案
问题二：有非特异性带 可能原因
电泳带型异常
非变性电泳：
上样量超过 3ug，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧， 均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。
变性电泳条带变淡：

EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，
变性电泳比非变性电泳要淡一些；
甲醛的质量不高 。
下游实验效果不佳
RNA 降解
抽提试剂的残留
• • •

动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快
速，样品保持冷冻
样品量适当，保证充分裂解 为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量
影响RNA提取的因素
纯化：
在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速； 经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长， 易造成 RNA 降解； 柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反 应的杂质，是目前较为理想的选择。
2）荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧 光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）
EB与DNA的结合
500l全血提取的基因组DNA电泳
动物组织提取基因组DNA
纯度鉴定
紫外分光光度法：
在260nm和280nm处测定DAN溶液的光吸收，纯的DNA，



蛋白质污染：
不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分 层的离心力和时间要足够。
减少起始样品量，确保裂解完全、彻底

解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。


苯酚残留：
不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分 层的离心力和时间要足够。 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。
建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更 多裂解液。
RNA降解
冷冻样品：
样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至 -70℃冰箱保存。样品要相对小一点；
先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；
样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须 预冷，碾磨过程中及时补充液氮。
OD260 /OD280 比值偏低
由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚 丙烯酰胺凝胶等, 降低了对流运动．故已知摩擦系数是分子的大小、极性及介 质粘度的函数．因此根据分子大小的不同、构型或形状的差异。以及所带的 净电荷的多寡。便可以通过电泳将蛋白质或核园分子混合初中的各种成分被 此分离开来。
1.琼脂糖凝胶电泳