MTT法检测细胞活力讲解

注意事项
1． 选择适当的细胞接种浓度。在进行MTT试验前，对每 一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数 条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和 培养时间。
2． 设空白对照，与试验平行设不加细胞只加培养液的空 白对照孔。最后比色时，以空白孔调零。
实验前应明确的问题
• 1.选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养
实验结果统计学处理
• 所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分 析，p<0.05时为相差显著，p<0.01时为相差非常显 著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞 生线曲线，专门公式求IC50（半数抑制浓度 ）。或 计算抑制率。 OD对照组-OD实验组 ×100 % • 抑制率 % = OD对照组
板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞 贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行 预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件 下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间 ，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶 形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性 降低，太少观察不到差异。
活细胞+MTT
琥珀酸脱
氢酶
紫蓝色结晶物 Formazan
贴壁细胞操作步骤
1. 接种细胞：用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含血 清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔2000-3000个细胞接 种于96孔培养板中，每孔体积90 ul。 （边缘孔用PBS或空白 培养基填充）。 2. 培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5% CO2 及饱和湿度条件下培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板 ，大约12h），加入浓度梯度的药物。原则上，细胞贴壁后即 可加药，每孔加药10 ul，一般设5个复孔。 3. 5%CO2，37℃孵育分别孵育24小时后，倒置显微镜下观 察。
4. 每孔加入10ul MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续 培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小 心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。 5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。 6. 每孔加入100ul二甲基亚砜（置摇床上低速振荡10min，使 结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸 光值。 7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔 （细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜）
药物的配制
• 浓度 • 体积 • 过滤
MTT的配制
• MTT一般最好现用现配，过滤后4º C避光保存两周内有效，或配制成 5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用 避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。尤其当MTT变为灰绿 色时就绝对不能再用了。 • MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配 成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有 关系，因为时间较短。
悬浮细胞操作步骤：
• 1）将细胞离心收集后，调节细胞悬液浓度大约1×104/ml，每孔先加 细胞悬液90ul,相应梯度的药物每孔10ul；共100ul加入到96孔板（边缘 孔用PBS填充）。每板设对照。同时设置调零孔（培养基、MTT、二 甲基亚砜），对照孔（细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设5 个复孔。 • 2）置37℃，5%CO2孵育24小时，倒置显微镜下观察。 • 3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h • 4）每孔加三联裂解液（10gSDS，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml用双蒸 水溶解配成100ml）过夜， 第二天早晨置摇床上低速振荡10 min，使 结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm测量各孔的吸光值。
MTT法检测细胞活力
甘肃中医药大学
MTT法目的和意义
检测细胞存活和生长情况 用于评价药物产生的细胞毒作用
原理
• 四唑盐（噻唑蓝）是一种能接受氢原子的染料，简称MTT • 活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难 溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。 二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的紫蓝色结晶物，用酶 联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映 活细胞数量，从而反映细胞的增殖情况。 • 在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与活细胞数成正 比。
实验结果统计学处理
公式如下： • lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4) Xm:lg 最大剂量 I:lg(最大剂量/相临剂量) P:阳性反应率之和 Pm:最大阳性反应率 Pn:最小阳性反应率
举例
• 药物浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、 0.000001umol/l，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率 为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入 计算公式： Pm=0.95 Pn=0.06 P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1 Xm=lg0.1=-1 lgI=lg0.1/0.01=1 lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025 IC50=0.00025
2.药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果
再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓 度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓 度根本不是药物的有效浓度和时间。 3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入 excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变 化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个 时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖 抑制表现的最明显）。
பைடு நூலகம்
4.培养时间。100ul的培养液对于10的4～5次方的增
殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话， 细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果， 我们是在48h换液的。
5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不 能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因