肠杆菌检验程序(详细版)

肠杆菌科 【器材】
一、
SS 平板培养基：选择性培养基，有促进目的菌生长的物质和鉴别用指示齐U
1煌绿、胆盐、硫代硫酸钠、枸橼酸钠等能抑制 G+菌及大多数大肠生长，胆盐促进伤寒生长。

2、 大肠分解乳糖产酸：中性红（
6.8红—8.0黄）变红，与胆盐结合合成胆酸，因而形成中心混浊的
深红色菌落，病原菌不分解乳糖，故菌落呈透明微黄色。

3、 枸橼酸铁能指示硫化氢产生，硫化铁呈黑色
4、 硫代硫酸钠有缓和胆盐对志贺、沙门菌的毒害作用，并中和煌绿、中性红染料的毒性，使大肠红 色鲜明
二、 KIA 斜面培养基：用酚红作指示剂（6.8黄—8.4红）。

上层为固体琼脂斜面，含乳糖。

下层为半 固体琼脂，含葡萄糖，含硫酸亚铁。

1细菌如能发酵乳糖和葡萄糖产酸产气，则斜面及底层均呈黄色，且有气泡。

非致病菌（如大肠埃 希菌）一般既可利用乳糖也可利
用葡萄糖，但肺克也是如此。

2、 如细菌只发酵葡萄糖不发酵乳糖，因 葡:乳为1:10，斜面所产生的少量的酸可因接触空气而氧化 挥发，从而使斜面
部分保持原来的红色；底层则是在相对缺氧的状态下，所生成的酸不被氧化挥发而 保持黄色。

致病菌一般不能利用乳糖，可用于区别致病
/非致病菌。

3、 如细菌分解蛋白质产生硫化氢，则与硫酸亚铁反应生成硫化亚铁（黑色沉淀物）
左：不发酵乳糖，强产硫化氢。

中：不发酵乳糖，不产硫化氢。

右：发酵乳糖，不产硫化氢
4、接种方法：先穿刺到底，
【实验内容】
一、 氧化酶试验 原理：见奈瑟菌属部分 操作：取氧化酶纸片，刮去 紫色为阳性，不变为阴性 变形杆菌为阴性）。

注意事项：因SS 培养基中的化学成分和生化反应复杂，其菌落可使滤纸变为紫红色，故对肠道杆菌 进行触酶和氧化酶试验时，宜从普通平板或
KIA 斜面上取菌，以保证试验结果正确。

二、 动力试验： 原理：有动力的细菌在半固体培养基中沿穿刺线扩散生长。

培养基: 半固体培养基
方法：分别穿刺接种大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，
37 C 孵育16-18h
结果：穿刺线扩散，培养基透明度减低为动力阳性；穿刺线清晰，培养基透明为动力阴性。

本试验, 大肠为（+）,肺杆为（-） 三、吲哚试验：（靛基质试验）
原理：有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，与对二甲基氨基苯甲醛形成红色 化合物。

培养基：蛋白胨水
方法：将大肠埃希菌和伤寒沙门菌分别接种于蛋白胨水培养基中， 37 C 孵育16-18h
结果：取出后，滴加吲哚试剂 2d ，混匀，可见培养物上层呈玫瑰红色为
+，不变色为-。

本试验，大肠
为（+）,伤寒为（-）
，使培养基变黑。

再在斜面划线。

KIA 或普通平板或普通平板上的较大菌落，观察纸片颜色的变化，呈蓝
（如试剂为盐酸二甲基对苯二胺，
阳性者则为红色）。

肠杆菌科多为阳性（但
四、尿素酶试验：
原理：产生尿素酶的细菌能分解尿素，形成氨，使培养基呈碱性，酚红指示剂变成红色。

培养基：尿素培养基
方法：将大肠埃希菌和变形杆菌分别接种于尿素培养基中，37 C孵育16-18h
结果：培养基变红色者为阳性。

变黄为阴性。

本试验，大肠为（-）,变形为（+）
五、甲基红试验：
原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解为甲酸、乙酸等，故培养物pH在4.5
以下，加入甲基红指示剂后呈红色。

有些细菌分解葡萄糖产生的酸进一步转化为其它物质，如醇、酮等，培养基pH在6.2以上，加入甲基红指示剂呈黄色。

培养基: 葡萄糖蛋白胨水
方法：分别接种大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌
结果：加入甲基红指示剂2d,混匀，红色为阳性，黄色为阴性。

本试验，大肠为（+），肺杆为（-）
六、苯丙氨酸脱氨酶试验：
原理：某些细菌（如变形杆菌属），可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱氨生成苯丙酮酸，加入三氯化铁试剂与苯丙酮酸螯合后形成绿色化合物。

培养基: 苯丙氨酸琼脂培养基
方法：分别接种大肠埃希菌和变形杆菌，37 C孵育16-18h
结果：滴加100 g/L三氯化铁试剂，出现绿色为+,不变为-。

本试验，变形为（+），大肠为（-）
七、柠檬酸盐利用试验：
原理：当细菌可以利用铵盐作为唯一的氮源，同时利用柠檬酸钠作为唯一碳源时，可在柠檬盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐为碳酸盐，使培养基变碱，指示剂溴麝香草酚蓝由绿色变为深蓝色，为柠檬酸盐利用试验阳性。

若不能利用则不能生长，培养基不变色，为阴性。

培养基: 檬酸盐培养基
方法：分别接种大肠埃希菌和变形杆菌，37 C孵育16-18h
结果：大肠-（绿色），变形+ （蓝色）
八、总结：结果判断与观察
KIA :观察上部和下部的颜色变化，变黄为产酸，变红为产碱，有气泡为产气，有黑色为产硫化氢。

动力（M ）：半固体上沿穿刺线生长，周围清澈，为阴性，周围混浊者为阳性。

吲哚（I）:在蛋白胨水中滴加靛基质试剂2-3滴，立刻变红者为阳性，不变为阴性。

尿素酶试验（U）:变为深粉红者为阳性，不变或变黄者为阴性。

甲基红试验（Mr）:在葡胨水中滴加甲基红试剂2-3滴，变红为阳性，变黄为阴性。

枸橼酸盐利用试验（C）:细菌在上生长，颜色变为蓝色为阳性，细菌不长或培养基颜色不变为阴性。

苯丙氨酸酶试验：在斜面上滴试剂滴，变成暗绿色为阳性，不变为阴性。

加
【其他试验】
一、大肠埃希菌
1形态结构观察：革兰阴性、中等大小、两端钝圆、多呈单个散在分布的杆菌。

鞭毛染色为周毛菌
2、菌落观察：在普通琼脂平板上呈圆形、灰白色、湿润、光滑型菌落；在血琼脂平板上呈圆形、灰白色、湿润、光滑型菌落，某些菌株有B溶血；在SS琼脂平板上呈红色、圆形、凸起、边缘整齐的
菌落，多数为光滑型菌落。

二、志贺菌属
1形态结构观察：为格兰阴性杆菌，散在分布，多无鞭毛
2、菌落观察：在SS和MAC平板上形成无色透明、中等大小的菌落，除宋内氏志贺菌外，菌落均为光滑型。

3、血清学试验：凡生化反应符合志贺菌属者均需做血清学鉴定。

①方法：取一环志贺菌四种多价血清与载玻片一端，再取少许待测菌与之混合，同时在玻片另一端取待测菌与之混合，同时在另一端取待测菌与生理盐水混合对照。

②结果判定：对照呈均匀浑浊，待检菌与志贺菌四种多价血清混合后，数分钟内出现肉眼可见的颗粒状凝集物即为阳性。

继之用A/B/C/D群最常见的单价血清凝集定种。

志贺氏菌屈血清凝集
四种多价血淸（NS对照》
1
凝集
福氏多价弹清凝集宋内氏多俗血清凝集
福氏志贺菌宋内点贺菌
③报告：分离培养未见可疑菌落或经鉴定不符合志贺菌属鉴定依据者可报告“未分离到志贺菌属细
菌”。

经分离鉴定后符合鉴定依据者，可报告“分离出XX志贺菌”，若进一步做多种生化反应及因子
血清分型后，可报告“分离出XX志贺菌X型”。

二、伤寒沙门菌属
1形态结构观察：沙门菌属为革兰阴性细长杆菌，鞭毛染色可见周鞭毛。

2、菌落观察：在SS和MAC平板上形成无色、半透明、光滑湿润、凸起的小菌落，产硫化氢的菌种可在SS平板上形成中心带黑褐色的小菌落。

3、血清学试验：若生化反应及形态学检查疑为沙门菌，可选用沙门菌的多价诊断血清进行玻片凝集
试验•
①方法：首先选用A~F组多价“ 0”诊断血清做玻片凝集试验。

在试验时以生理盐水作对照。

本试验在5~10 min内不出现凝集者可确定为阴性。

但若生化反应比较典型，应考虑选用Vi凝集试验，若凝
集，则用无菌生理盐水将菌洗下，制成浓厚的悬液，100C加热30min，再与A~F组多价“ 0”诊断
血清做玻片凝集试验。

若与A~F组多价“ 0”血清发生凝集，应再与沙门菌单价因子血清分别做玻片凝集试验，以确定该菌株属于哪一组。

一般先选用本地区检出率最高的菌型的相应血清做玻片凝集。

若已确定哪一沙门菌种后，再分别先用H因子血清检查第I相抗原，然后检查第II相抗原，最后
确定该菌种属于哪一型沙门菌。

厂沙门茵属血清7-凝糾
A・F多价了”血清(NS对照)
凝集单价血淸
②报告：分离培养未见可疑菌落或经鉴定不符合沙门菌属细菌者，可报告“未分离出沙门菌”。

生化
反应符合沙门菌，玻片凝集试验阳性者，可初步报告为“分离到XX沙门菌”或“ X群沙门菌”。

二、肺炎克雷伯菌
1、形态结构观察：为无芽孢格兰阴性杆菌，呈卵圆形或球杆状，常呈双排列，无鞭毛。

2、菌落观察：在血琼脂平板上形成圆形、凸起、灰白色、不溶血、光亮的大菌落，相邻菌落易于融
合，黏液状，若用接种针蘸取呈长丝状拽起。

在MAC平板上呈乳糖发酵产酸的菌落，即红色、较大、
浑浊、凸起的粘液型菌落，较大肠埃希菌大。

与大肠埃希菌鉴别
四、变形杆菌
1、形态结构观察：为革兰阴性杆菌，两端钝圆，有明显多形性，在一定条件下可形成球杆状或丝状；无芽孢和荚膜，鞭毛染色为周鞭毛。

2、菌落观察：在营养琼脂平板上呈波纹状迁徙生长现象；在SS琼脂平板上呈无色、圆形、中等大小的乳糖不发酵型菌落，中心通常为灰褐色。

接种选择性培养基（SS ，麦康凯，伊红美蓝）
35 C 24小时
挑取可疑菌落（SS 上非红色菌）
GS,氧化酶，（药敏）
（KIA ，MIU ，IMViC ，苯丙氨酸）
肠杆菌科初步鉴定，作血清凝集
最终结果
肠杆菌鉴定程
序
粪便标本
其他标本 G-杆菌或球杆菌形态
杆菌或弧菌
G 杆菌或弧菌 氧
化酶（+）
氧化酶（-）
杆菌
接种血平板，GS
非发酵菌科
弧菌科。