基因工程制药新版(2)
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第三节 基因工程制药生产的基本过程
一、工具酶的分离纯化 二、载体的分离纯化 三、外源DNA和目的基因的分离和获得 四、外源DNA与载体DNA的切割与连接 五、宿主细胞的选择和基因导入操作 六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点 七、基因工程菌中试 八、基因工程菌的扩增和发酵生产 九、基因工程药物的分离和纯化技术 十、变性蛋白的复性 十一、基因工程药物的质量控制 十二、基因工程药物的制造实例
（1）DNA的纯度 （2）DNA的甲基化程度 （3）DNA的结构 （4）反应的温度----最适温度为37度 （5）反应的缓冲体系----反应体系中通常含有
MgCl2、NaCl、KCl、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、 牛血清白蛋白。它们具有激活酶、稳定酶的作用。
（三）关于连接酶
1、定义----凡是能够催化DNA片段5’-末端的磷酰基与3’末端的羟基结合成磷酸二酯键的酶，称为连接酶。
※EcoB(大肠杆菌B株)的核酸酶不能识别已甲基
化 的序列。
ECOB核酸酶
甲基化酶
CH3
TGAN8TGCT ACTN8ACGA
TGAN8TGCT ACTN8ACGA
噬菌体来源序列
CH3 CH3 CH3
宿主来源序列
R/M体系的作用：
保护自身的DNA不受限制； 破坏外源DNA使之迅速降解
※限制性内切酶本是微生物细胞中用于 专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功 能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体 的感染，是细胞中的一种防御机制。
5、基因工程所用到的限制酶
通常是Ⅱ型限制酶，具体有以下几种。
EcoR-I
Hind-III
BamH-I
Pst-I
Sst-I
Sal-I
Ava-I
Bcl-I
Hind-II
Hpa-I
Bgl-II
Cla-I
Hae-III
Hha-I
Hinf-I
Hpa-II
Mbo-I
Sma-I
Xba-I
Xho-I
6、影响限制酶作用的因素
（三）基因工程载体的种类
1、细菌质粒 2、真核基因病毒DNA 3、λ噬菌体DNA 4、单链DNA噬菌体M13载体 5、人工质粒载体----科斯质粒 6、酵母人工染色体 7、其他载体
2、作用----主要用于 （1）正常DNA的合成。 （2）损伤DNA的修复。
3、种类 （1）DNA-连接酶----广泛存在于生物细胞之中，主要取 自于大肠杆菌E.coli。 （2）T4-DNA连接酶----来自于经过T4-噬菌体感染的大肠 杆菌E.coli。 （3 T4-RNA连接酶----催化单链DNA或RNA的5‘磷酸与另 一单链DNA或RNA的3’羟基之间形成共价连接。
（3）Ⅲ型限制酶-----对DNA的识别与切割点不同， 不产生特异性DNA片段。
3、限制酶的特征
具有专一性的识 别位点。
能够形成固定的 核苷酸单链末端。
比较适合于进行 DNA结构的分析和 进行基因重组。
4、限制酶的作用
（1）进行DNA重组。 （2）构建新载体。 （3）构建基因文库。 （4）进行DNA序列分析。 （5）制备DNA放射性探针。
R/M体系：
是由两种酶活性配合完成的： 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶
E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶
※当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中 有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。 而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列， 但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲 硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的 特定碱基，使之甲基化。
血红蛋白的基因工程流程
血红蛋白基因
血红蛋白基因排列顺序
血红蛋白的结构
血红蛋白的运送氧气功能
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
一、工具酶的分离纯化
（一）基因工程制药所用到的工具酶 （二）关于限制酶 （三）关于连接酶
（一）基因工程制药所用到的工具酶
限制性内切酶 Klenow聚合酶 T4-多核苷酸激酶 核酸酶-S1 绿豆核酸酶 人外切核酸酶 外切RNA酶-III DNA聚合酶1 末端脱氧核苷酸转移酶 逆转录酶
大肠杆菌-DNA连接酶
甲基化酶 T4-DNA聚合酶 碱性磷酸酶 核酸酶-Bal31
核糖核酸酶 DNA酶-1 外切RNA酶-VI
T4-DNA连接酶 T4-RNA连接酶
（二）关于限制酶
1、宿主限制现象 2、限制酶的定义 3、限制酶的特征 4、限制酶的作用 5、基因工程所用到的限制酶 6、影响限制酶作用的因素
（8）应具有灵活的克隆位点、并且有方便的筛选 标记。 （9）应具有很强的启动子。 （10）应具有阻遏子，使启动子受到控制，因为 外源基因的高效表达会抑制宿主细胞的生长、增 殖，而阻遏子可使宿主细胞免受这种影响。 （11）应具有很强的终止子，以便重点克隆外源 基因区段，而不转录其它无关基因。 （12）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号， 即含有起始密码AUG和SD序列，以便转录之后能够 顺利于进行翻译。
1、宿主限制现象
病毒或噬菌体在宿主A细胞中生长良好,但 在宿主B细胞中生长很差,原因是它的DNA受 到宿主B的限制,这种现象是宿主控制性限 制 （restriction）与修饰 (modification) ,简称（R/M体系）。
细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自 身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。
※由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成 为基因工程重要的工具酶。
2、限制酶的定义
凡是能够识别和切割DNA分子内特定核苷酸顺序的 酶称为限制酶。限制酶分为三个类型：
（1）Ⅰ型限制酶-----由于其切点不固定，很难形成 特异性的切割末端。
（2）Ⅱ型限制酶-----是位点特异性酶，是基因工程 理想的工具酶。
二、基因工程载体的分离纯化
（一）定义 （二）基因工程载体的必备条件 （三）基因工程载体的种类
（一）定义
能够将目的 基因携带进 宿主细胞、 并可使得目 的基因能够 在宿主体内 进行自主性 复制的遗传 因子，称为 基因工程载 体。
（二）基因工程载体的必备条件
（1）具有有效运载能力。 （2）载体自身能够独立复制，并且在宿主体内进 行自主性复制。 （3）载体在携带目的基因之后，还能够在宿主体 内进行自主性复制。 （4）在宿主体内，能够控制外源基因的表达活动。 （5）能够携带大小不同的外源性目的基因。 （6）鉴定方便、装卸技术简单。 （7）容易控制、安全可靠。
一、工具酶的分离纯化 二、载体的分离纯化 三、外源DNA和目的基因的分离和获得 四、外源DNA与载体DNA的切割与连接 五、宿主细胞的选择和基因导入操作 六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点 七、基因工程菌中试 八、基因工程菌的扩增和发酵生产 九、基因工程药物的分离和纯化技术 十、变性蛋白的复性 十一、基因工程药物的质量控制 十二、基因工程药物的制造实例
（1）DNA的纯度 （2）DNA的甲基化程度 （3）DNA的结构 （4）反应的温度----最适温度为37度 （5）反应的缓冲体系----反应体系中通常含有
MgCl2、NaCl、KCl、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、 牛血清白蛋白。它们具有激活酶、稳定酶的作用。
（三）关于连接酶
1、定义----凡是能够催化DNA片段5’-末端的磷酰基与3’末端的羟基结合成磷酸二酯键的酶，称为连接酶。
※EcoB(大肠杆菌B株)的核酸酶不能识别已甲基
化 的序列。
ECOB核酸酶
甲基化酶
CH3
TGAN8TGCT ACTN8ACGA
TGAN8TGCT ACTN8ACGA
噬菌体来源序列
CH3 CH3 CH3
宿主来源序列
R/M体系的作用：
保护自身的DNA不受限制； 破坏外源DNA使之迅速降解
※限制性内切酶本是微生物细胞中用于 专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功 能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体 的感染，是细胞中的一种防御机制。
5、基因工程所用到的限制酶
通常是Ⅱ型限制酶，具体有以下几种。
EcoR-I
Hind-III
BamH-I
Pst-I
Sst-I
Sal-I
Ava-I
Bcl-I
Hind-II
Hpa-I
Bgl-II
Cla-I
Hae-III
Hha-I
Hinf-I
Hpa-II
Mbo-I
Sma-I
Xba-I
Xho-I
6、影响限制酶作用的因素
（三）基因工程载体的种类
1、细菌质粒 2、真核基因病毒DNA 3、λ噬菌体DNA 4、单链DNA噬菌体M13载体 5、人工质粒载体----科斯质粒 6、酵母人工染色体 7、其他载体
2、作用----主要用于 （1）正常DNA的合成。 （2）损伤DNA的修复。
3、种类 （1）DNA-连接酶----广泛存在于生物细胞之中，主要取 自于大肠杆菌E.coli。 （2）T4-DNA连接酶----来自于经过T4-噬菌体感染的大肠 杆菌E.coli。 （3 T4-RNA连接酶----催化单链DNA或RNA的5‘磷酸与另 一单链DNA或RNA的3’羟基之间形成共价连接。
（3）Ⅲ型限制酶-----对DNA的识别与切割点不同， 不产生特异性DNA片段。
3、限制酶的特征
具有专一性的识 别位点。
能够形成固定的 核苷酸单链末端。
比较适合于进行 DNA结构的分析和 进行基因重组。
4、限制酶的作用
（1）进行DNA重组。 （2）构建新载体。 （3）构建基因文库。 （4）进行DNA序列分析。 （5）制备DNA放射性探针。
R/M体系：
是由两种酶活性配合完成的： 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶
E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶
※当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中 有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。 而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列， 但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲 硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的 特定碱基，使之甲基化。
血红蛋白的基因工程流程
血红蛋白基因
血红蛋白基因排列顺序
血红蛋白的结构
血红蛋白的运送氧气功能
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
一、工具酶的分离纯化
（一）基因工程制药所用到的工具酶 （二）关于限制酶 （三）关于连接酶
（一）基因工程制药所用到的工具酶
限制性内切酶 Klenow聚合酶 T4-多核苷酸激酶 核酸酶-S1 绿豆核酸酶 人外切核酸酶 外切RNA酶-III DNA聚合酶1 末端脱氧核苷酸转移酶 逆转录酶
大肠杆菌-DNA连接酶
甲基化酶 T4-DNA聚合酶 碱性磷酸酶 核酸酶-Bal31
核糖核酸酶 DNA酶-1 外切RNA酶-VI
T4-DNA连接酶 T4-RNA连接酶
（二）关于限制酶
1、宿主限制现象 2、限制酶的定义 3、限制酶的特征 4、限制酶的作用 5、基因工程所用到的限制酶 6、影响限制酶作用的因素
（8）应具有灵活的克隆位点、并且有方便的筛选 标记。 （9）应具有很强的启动子。 （10）应具有阻遏子，使启动子受到控制，因为 外源基因的高效表达会抑制宿主细胞的生长、增 殖，而阻遏子可使宿主细胞免受这种影响。 （11）应具有很强的终止子，以便重点克隆外源 基因区段，而不转录其它无关基因。 （12）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号， 即含有起始密码AUG和SD序列，以便转录之后能够 顺利于进行翻译。
1、宿主限制现象
病毒或噬菌体在宿主A细胞中生长良好,但 在宿主B细胞中生长很差,原因是它的DNA受 到宿主B的限制,这种现象是宿主控制性限 制 （restriction）与修饰 (modification) ,简称（R/M体系）。
细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自 身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。
※由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成 为基因工程重要的工具酶。
2、限制酶的定义
凡是能够识别和切割DNA分子内特定核苷酸顺序的 酶称为限制酶。限制酶分为三个类型：
（1）Ⅰ型限制酶-----由于其切点不固定，很难形成 特异性的切割末端。
（2）Ⅱ型限制酶-----是位点特异性酶，是基因工程 理想的工具酶。
二、基因工程载体的分离纯化
（一）定义 （二）基因工程载体的必备条件 （三）基因工程载体的种类
（一）定义
能够将目的 基因携带进 宿主细胞、 并可使得目 的基因能够 在宿主体内 进行自主性 复制的遗传 因子，称为 基因工程载 体。
（二）基因工程载体的必备条件
（1）具有有效运载能力。 （2）载体自身能够独立复制，并且在宿主体内进 行自主性复制。 （3）载体在携带目的基因之后，还能够在宿主体 内进行自主性复制。 （4）在宿主体内，能够控制外源基因的表达活动。 （5）能够携带大小不同的外源性目的基因。 （6）鉴定方便、装卸技术简单。 （7）容易控制、安全可靠。