流式细胞术
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BD Accuri™ C6 ——2-laser, 4-color
FL1: FITC, BD Horizon Brilliant Blue 515, Alexa Fluor 488, CFSE, GFP, YFP ; FL2: PE, PI, PE-CF594, YFP; FL3: PerCP, PE-Cy5, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, PI, 7-AAD, RFP, PI, PE-CF594, PerCP-eFluor® 710; FL4: APC, Alexa Fluor 647.
33
BD FACSVerse™——3-laser, 8-color (4-2-2)
FL1: FITC, BD Horizon Brilliant Blue 515, Alexa Fluor 488, CFSE, GFP; FL2: PE, PI ; FL3: PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy5, 7-AAD, PerCP-eFluor® 710; FL4: PE-Cy7; FL5: APC, Alexa Fluor 647; FL6: APC-Cy7, APC-H7, APC-eFluor® 780, APC-Fire™ 750; FL7: BD Horizon™ V450, Pacific Blue™, DAPI BD Horizon™ Violet Proliferation Dye 450, BD Horizon™ Fixable Viability Stain 450, BD Horizon Brilliant™ Violet 421, eFluor® 450; FL8: BD Horizon™ V500, BD Horizon Brilliant™ Violet 510, AmCya.
流式细胞术 Flow cytometry
DATE:
2019.08.21
REPORTER: Wenlong Xu
1
2
第一讲--流式细胞术（概述篇）
1.定义
什么是流式细胞术？
流式细胞术
2.检测目标
流式细胞术能检测哪些样本？
4.结果呈现
流式数据的呈现形式有哪些？
3.检测参数
流式细胞术能检测哪些参数？
3
5
Fluidics
6
Optics
PE-Cy5 PE-Cy7 PE FITC
PE-TxRed
SSC
488nm激光侧面接收光光信号分离示意图
7
1.定义
什么是流式细胞术？
流式细胞术
2.检测目标
流式细胞术能检测哪些样本？
4.结果呈现
流式数据的呈现形式有哪些？
3.检测参数
流式细胞术能检测哪些参数？
8
2、流式细胞术能够检测哪些样本？
24
λ355（紫外）
λ405（紫光）
激发光
（常用）
λ488（蓝光）
流 式
λ561（绿光）
细
λ633（红光）
胞 反光镜
仪
滤光片
25
Violet ：400-450nm Blue ：450-500nm Green：500-570nm Yellow：570-590nm Orange：590-610nm Red：610-700nm
2-laser, 5-color
FL1: FITC; FL2: PE; FL3: PE-Texas Red (ECD), eFluor® 605NC; FL4: PE-Cy7 (PC7); FL5: APC, APC-Cy7
35
CytoFLEX
36
37
FSC: 反应细
21
区分白细胞亚群
人外周血细胞涂片
22
FSC与SSC 流式配色 配色实例 流式细胞仪的参数
23
荧光素发光原理
当荧光素某一特定轨道电子能被激光含有的光子拉动跃迁到高能
级轨道，荧光素的电子才能吸收该能量，荧光素的能级差决定了
特定的荧光素只能吸收某一波长的光。
9
样本大小
从细菌到单核细胞（0.5μm-14μm）
10
组织细胞
11
1.定义
什么是流式细胞术？
流式细胞术
2.检测目标
流式细胞术能检测哪些样本？
4.结果呈现
流式数据的呈现形式有哪些？
3.检测参数
流式细胞术能检测哪些参数？
12
3、流式细胞术能够检测样本哪些参数？
Relative size Relative internal complexity Relative fluorescence intensity
31
FSC与SSC 流式配色 配色实例 流式细胞仪的参数
32
常用流式细胞仪的参数
BD FACSCalibur™—— 2-laser, 4-color
FL1: FITC, BD Horizon Brilliant Blue 515, Alexa Fluor 488, CFSE, GFP ; FL2: PE, PI; FL3: PerCP, PE-Cy5, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, PI, 7-AAD, PI, PerCP-eFluor® 710; FL4: APC, Alexa Fluor 647.
13
1.定义
什么是流式细胞术？
流式细胞术
2.检测目标
流式细胞术能检测哪些样本？
4.结果呈现
流式数据的呈现形式有哪些？
3.检测参数
流式细胞术能检测哪些参数？
14
4.流式细胞术的数据呈现形式有哪些？
流式数据的 呈现形式
Histograms直方图 Cytograms图
Histograms
15
Cytograms 小鼠脾脏中的Treg细胞
1、什么是流式细胞术?
Flow Cytometry
Fluid Cell Measurement
流式细胞术就是利用流式细胞仪对处在快速直线流动状态中的单列 细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选 的技术。
4
Fluidics
Optics
FCM Electronics
PMT: Photomultiplier tube
26
流式配色
待测分子 表达水平
荧光素 的强度
配色原则：
表达水平越低的分子选择越强的荧光素 标记的抗体；
表达水平越高的分子可选择较低强度荧 光素标记的抗体。
另外，实验中最重要的分子优先考虑最强 或者较强的荧光素标记的抗体。
总之，优先选择强的荧光素。
27
强
荧 光 素 的 强 度
弱
28
FSC与SSC 流式配色 配色实例 流式细胞仪的参数
散点图 伪色图
最常用
等高线图
较常用
（目标细胞数较少）
密度图 斑马线图
不常用
16
第二讲--流式细胞术（深度篇）
17
FSC与SSC 流式配色 配色实例 流式细胞仪的参数
18
FSC和SSC
FSC: Forward scatter SSC: Side scatter
物理属性：细胞经激光照射发出散射光
19
29
实例
小鼠脾脏中Treg细胞（CD3+CD4+CD25+Foxp3+）的配色
1.认识流式细胞仪荧光参数
BD FACSCalibur
488nm激发光 633nm激发光
FITC PE Percp-Cy5.5 APC
30
2.荧光素强弱排序
PE＞APC＞Percp-Cy5.5＞FITC
3.待标记分子表达高低排序 CD4＞CD3＞CD25＞Foxp3 4.应用阴阳配色学说 Treg细胞中最重要的分子，也是这个实验的目的分子Foxp3 综上所述，我们选择Foxp3-PE, CD25-APC, CD3-percp-Cy5.5, CD4-FITC。
34
FC500
Beckman Coulter
1-laser, 5-color
FL1: FITC; FL2: PE; FL3: PE-Texas Red (ECD), eFluor® 605NC; FL4: PE-Cy5 (PC5), PerCP-eFluor® 710; FL5: PE-Cy7 (PC7);
FL1: FITC, BD Horizon Brilliant Blue 515, Alexa Fluor 488, CFSE, GFP, YFP ; FL2: PE, PI, PE-CF594, YFP; FL3: PerCP, PE-Cy5, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, PI, 7-AAD, RFP, PI, PE-CF594, PerCP-eFluor® 710; FL4: APC, Alexa Fluor 647.
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BD FACSVerse™——3-laser, 8-color (4-2-2)
FL1: FITC, BD Horizon Brilliant Blue 515, Alexa Fluor 488, CFSE, GFP; FL2: PE, PI ; FL3: PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy5, 7-AAD, PerCP-eFluor® 710; FL4: PE-Cy7; FL5: APC, Alexa Fluor 647; FL6: APC-Cy7, APC-H7, APC-eFluor® 780, APC-Fire™ 750; FL7: BD Horizon™ V450, Pacific Blue™, DAPI BD Horizon™ Violet Proliferation Dye 450, BD Horizon™ Fixable Viability Stain 450, BD Horizon Brilliant™ Violet 421, eFluor® 450; FL8: BD Horizon™ V500, BD Horizon Brilliant™ Violet 510, AmCya.
流式细胞术 Flow cytometry
DATE:
2019.08.21
REPORTER: Wenlong Xu
1
2
第一讲--流式细胞术（概述篇）
1.定义
什么是流式细胞术？
流式细胞术
2.检测目标
流式细胞术能检测哪些样本？
4.结果呈现
流式数据的呈现形式有哪些？
3.检测参数
流式细胞术能检测哪些参数？
3
5
Fluidics
6
Optics
PE-Cy5 PE-Cy7 PE FITC
PE-TxRed
SSC
488nm激光侧面接收光光信号分离示意图
7
1.定义
什么是流式细胞术？
流式细胞术
2.检测目标
流式细胞术能检测哪些样本？
4.结果呈现
流式数据的呈现形式有哪些？
3.检测参数
流式细胞术能检测哪些参数？
8
2、流式细胞术能够检测哪些样本？
24
λ355（紫外）
λ405（紫光）
激发光
（常用）
λ488（蓝光）
流 式
λ561（绿光）
细
λ633（红光）
胞 反光镜
仪
滤光片
25
Violet ：400-450nm Blue ：450-500nm Green：500-570nm Yellow：570-590nm Orange：590-610nm Red：610-700nm
2-laser, 5-color
FL1: FITC; FL2: PE; FL3: PE-Texas Red (ECD), eFluor® 605NC; FL4: PE-Cy7 (PC7); FL5: APC, APC-Cy7
35
CytoFLEX
36
37
FSC: 反应细
21
区分白细胞亚群
人外周血细胞涂片
22
FSC与SSC 流式配色 配色实例 流式细胞仪的参数
23
荧光素发光原理
当荧光素某一特定轨道电子能被激光含有的光子拉动跃迁到高能
级轨道，荧光素的电子才能吸收该能量，荧光素的能级差决定了
特定的荧光素只能吸收某一波长的光。
9
样本大小
从细菌到单核细胞（0.5μm-14μm）
10
组织细胞
11
1.定义
什么是流式细胞术？
流式细胞术
2.检测目标
流式细胞术能检测哪些样本？
4.结果呈现
流式数据的呈现形式有哪些？
3.检测参数
流式细胞术能检测哪些参数？
12
3、流式细胞术能够检测样本哪些参数？
Relative size Relative internal complexity Relative fluorescence intensity
31
FSC与SSC 流式配色 配色实例 流式细胞仪的参数
32
常用流式细胞仪的参数
BD FACSCalibur™—— 2-laser, 4-color
FL1: FITC, BD Horizon Brilliant Blue 515, Alexa Fluor 488, CFSE, GFP ; FL2: PE, PI; FL3: PerCP, PE-Cy5, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, PI, 7-AAD, PI, PerCP-eFluor® 710; FL4: APC, Alexa Fluor 647.
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1.定义
什么是流式细胞术？
流式细胞术
2.检测目标
流式细胞术能检测哪些样本？
4.结果呈现
流式数据的呈现形式有哪些？
3.检测参数
流式细胞术能检测哪些参数？
14
4.流式细胞术的数据呈现形式有哪些？
流式数据的 呈现形式
Histograms直方图 Cytograms图
Histograms
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Cytograms 小鼠脾脏中的Treg细胞
1、什么是流式细胞术?
Flow Cytometry
Fluid Cell Measurement
流式细胞术就是利用流式细胞仪对处在快速直线流动状态中的单列 细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选 的技术。
4
Fluidics
Optics
FCM Electronics
PMT: Photomultiplier tube
26
流式配色
待测分子 表达水平
荧光素 的强度
配色原则：
表达水平越低的分子选择越强的荧光素 标记的抗体；
表达水平越高的分子可选择较低强度荧 光素标记的抗体。
另外，实验中最重要的分子优先考虑最强 或者较强的荧光素标记的抗体。
总之，优先选择强的荧光素。
27
强
荧 光 素 的 强 度
弱
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FSC与SSC 流式配色 配色实例 流式细胞仪的参数
散点图 伪色图
最常用
等高线图
较常用
（目标细胞数较少）
密度图 斑马线图
不常用
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第二讲--流式细胞术（深度篇）
17
FSC与SSC 流式配色 配色实例 流式细胞仪的参数
18
FSC和SSC
FSC: Forward scatter SSC: Side scatter
物理属性：细胞经激光照射发出散射光
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实例
小鼠脾脏中Treg细胞（CD3+CD4+CD25+Foxp3+）的配色
1.认识流式细胞仪荧光参数
BD FACSCalibur
488nm激发光 633nm激发光
FITC PE Percp-Cy5.5 APC
30
2.荧光素强弱排序
PE＞APC＞Percp-Cy5.5＞FITC
3.待标记分子表达高低排序 CD4＞CD3＞CD25＞Foxp3 4.应用阴阳配色学说 Treg细胞中最重要的分子，也是这个实验的目的分子Foxp3 综上所述，我们选择Foxp3-PE, CD25-APC, CD3-percp-Cy5.5, CD4-FITC。
34
FC500
Beckman Coulter
1-laser, 5-color
FL1: FITC; FL2: PE; FL3: PE-Texas Red (ECD), eFluor® 605NC; FL4: PE-Cy5 (PC5), PerCP-eFluor® 710; FL5: PE-Cy7 (PC7);