三种荧光定量PCR检测方法比较

三种荧光定量PCR检测方法比较

定量pcr：以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。

常见荧光定量PCR检测方法可分为以下几类：

(1) SYBR Green I 检测模式

SYBR Green I 是一种能与双链DNA 结合发光的荧光染料。其与双链DNA 结合后，

荧光大大增强。因此，SYBR Green I 的荧光信号强度与双链DNA 的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA 数量。SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。PCR 扩增程序一般为94℃～55℃～72℃三步法，40 个循环。SYBR Green I 的缺点：由于SYBR Green I 没有特异性，不能识别特定的双链，只要是双链就会结合发光，对PCR 反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，所以在临床上使用可能会有假阳性发生。

SYBR Green I 的优点：SYBR Green I 的优点是因为其缺点产生，由于它能所有的双链DNA 相结合，所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针，通用性较好，并且价格相对较低。这对科研是很有利的，因此国内外在科研中使用比较普遍。

(2) 水解探针模式(taq man探针)

TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5'末端，而淬灭剂则在3'末端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3'端的淬灭剂接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5'外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射释放随着扩增循环数的增加，一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。荧光。．

出来的荧光基团不断积累。因此Taqman 探针检测的是积累荧光。PCR 扩增程序通常是：94℃～60 ℃40 个循环。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。

(3) 杂交探针模式(Beacon、FRET)

分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补;茎一般5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂则标记在另一端。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。由于是酶切作用的存在，分子信标也是积累荧光。常用的荧光基团：FAM ，Texas Red 。PCR 扩增程个循环。40 ℃三步法，72 ～55～94序通常是：

FRET 探针又称双杂交探针，FRET 探针由两条相邻探针组成，在一条探针的5`端标记FAM 荧光基团，另一探针的3`端标记Red 640 荧光基团。当复性时，探针结合在模板上，FAM 基团和Red640 基团相邻，激发FAM 产生的荧光，作为Red640 基团的激发光被吸收，使Red640发出波长为640 的荧光。当变性时，探针游离，两基团距离远，不能产生640 波长的荧光。由于FRET 探针是靠近发光，所以检测信号是实时信号，非。LC-Red705，LC-Red640累积信号。常用的荧光基团是：

能用于实时荧光PCR 定量的方法很多，各有优缺点，应根据实验的需要和当前的实验条件选择适合自己的方法。下面为各种方法的比较：

实验中的一些好习惯：

加入试剂之前，把它混匀一下，以免放置时间长了浓度不均;移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性。

一定要记着关水浴箱，切记切记;多和大家讨论，同时多关注别人讨论的经验，这几乎是最快提

高的捷径了;所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因。

防止RNA酶污染的措施：

1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。

2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用)。

3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%

HO 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。224. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。

6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。

常用的RNA酶抑制剂：

1. 焦磷酸二乙酯(DEPC)：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。

3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。

4. RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin)：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA 酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。

5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

因为DEPC不加选择的修饰蛋白质和RNA，因此在分离和纯化RNA过程中不能使用，而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容

在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因的污染。)酶(RNA是核糖核酸酶．

RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。

研究人员造成的污染RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此进行RNA实验时应勤换手套。

但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理

动植物总RNA提取-Trizol法：

Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol 法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。

1. 将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。

2. 研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。

3. 取上层水相于一新的离心管，按每ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。

4. 弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g 离心5分钟。

5. 小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离，