肠道致病菌的分离与鉴定

肠道致病菌的分离与鉴定

一、实验目的

（1）掌握肠道致病菌的分离、鉴定的主要步骤

（2）掌握平板划线分离法

（3）掌握玻片凝集试验的操作方法以及实际意义

二、实验材料

（1）实验仪器：试管、玻片、酒精灯、接种针、接种环、试管架、（2）实验试剂：生理盐水、细菌培养基、伤寒诊断血清、伊红美蓝培养基（EMB）、克氏双糖铁培养基（KIA）、葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、甘露醇发酵管、尿素培养基、蛋白胨水、半固体培养基

三、实验流程

（1）肠道致病菌的分离

①待测标本的制作：把接种环放置于点燃的酒精灯火焰处对其进行灭菌，用已灭菌的接种环在细菌培养基中取少量待测细菌于盛有5ml生理盐水的试管中，混匀。

②细菌的分离接种：用接种环取适量配置好的细菌悬液，在酒精灯附近进行划线分离法接种细菌于EMB培养基。将培养基置于37℃培养18~24小时。

（2）肠道致病菌的纯化

①单菌落接种：从已培养待测细菌的EMB培养基上用已灭菌的接种针挑取某单个菌落接种到KIA培养基上，一部分直接深入培养基中底部，一部分直接涂抹于斜面处，置于37℃培养18~24小时。

②待测细菌的初步判断：取出已纯化培养待测细菌的KIA培养基，观察现象，初步断定该细菌是致病菌或是非致病菌。

（3）肠道致病菌的鉴定

①生化鉴定：分别取葡萄糖、乳糖、甘露醇发酵管各一只（注意管内的小倒管则应充满液体，不含气泡），用已灭菌的接种针取已培养的KIA培养基上的培养物接种于各发酵管，将各发酵管于37℃培养18~24小时。取出并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌）

②动力检查：用已灭菌的接种针取KIA培养基上的培养物分别接种于蛋白胨水、尿素培养基、半固体培养基中，将各个培养基于37℃培养18~24小时。取出后将靛基质（吲哚）加入到蛋白胨水培养基中，并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌）

③血清学鉴定：取洁净玻片一张，将其用蜡笔分为两格，两边各取生理盐水一滴，再用已灭菌的接种环分别取KIA培养基上的培养物加入两格中，与生理盐水混匀不摊开。（注意每次使用接种环前都应用酒精灯火焰进行灭菌）然后在第二格中滴入一滴伤寒诊断血清，混匀不摊开，轻轻摇动玻片，经1~2min观察两格中有无凝集现象。注：本实验涉及细菌接种都应在无菌条件下进行，由于条件有限，因而可在燃烧的酒精灯附近进行实验操作。

四、实验结果与分析

（1）EMB培养基现象与分析：

①培养基下部呈现黑色现象，上部培养基仍为红色，培养基斜面有细菌明显蔓延生长。

②分析：培养基下部出现黑色现象，说明该细菌能够分解培养基中的物质并产出硫化氢气体，由于培养基中含铁，因而硫化氢能够与

其结合成硫化铁，出现黑色现象；而上部因重力含铁量较少，产生的硫化氢气体又部分挥发，只有少部分能够与少量铁结合，故产生的现象不明显，上部仍呈现红色。

（2）生化鉴定现象与分析：

①葡萄糖发酵管：管内培养基指示剂由紫色变成黄色，其内可见细菌有明显生长现象，无气泡产生。

分析：培养基指示剂由紫色变成黄色，说明该细菌能够分解葡萄糖并产酸但不产气，使得指示剂内化学物质发生颜色改变。

②乳糖发酵管：管内培养基指示剂颜色不发生改变，仍为紫色，有明显细菌生长现象，无气泡产生。

分析：培养基指示剂不发生颜色改变，说明该细菌能分解乳糖但不能产酸也不产气，使得管内指示剂无明显现象。

③甘露醇发酵管：管内培养基指示剂由紫色变成黄色，其内可见细菌有明显生长现象，无气泡产生。

分析：培养基指示剂由紫色变成黄色，说明该细菌能够分解甘露醇并产酸但不产气，使得指示剂内化学物质发生颜色改变。

（3）动力检查现象与分析：

①尿素培养基：管内培养基指示剂颜色无明显变化，但有明显气泡产生，有明显细菌生长现象。

分析：管内培养基指示剂无明显颜色改变，说明该细菌不能分解尿素，但培养基中其他物质成分可以使细菌分解产气，因而产生气泡。

②蛋白胨水：管内指示剂颜色无明显变化，有明显细菌生长现象，无气泡产生。加入靛基质（吲哚）试剂后不出现玫瑰红色。

分析：加入靛基质指示剂后不呈现玫瑰红色，说明该细菌不能分解培

养基中的色氨酸产生靛基质，因而靛基质指示剂不能与之发生化学反应，出现颜色变化。

③半固体培养基：管内指示剂颜色无明显变化，有明显细菌沿穿刺线扩散生长现象，无气泡产生。

分析：细菌能够沿穿刺线生长，说明该细菌有鞭毛，能运动，有助于鉴别细菌种类。

（4）血清学鉴定现象与分析：

①现象：通过玻片两边对比，在加有伤寒杆菌诊断血清的第二个格子中周围液体清澈，有明显凝集现象；另一格液体表面浑浊，无凝集现象。

②分析：第二格中加入伤寒杆菌诊断血清出现凝集现象，说明接种细菌应为伤寒杆菌，二者特异性结合产生抗原抗体复合物，因而呈现凝集现象；而第一格中未加入伤寒杆菌诊断血清，接种细菌无相应抗体，不能产生抗原抗体复合物，所以不呈现凝集现象。

综上：

由此判断：该细菌应为乙型副伤寒杆菌。

五、实验总结

本次实验所需材料较多，实验流程较复杂，需要动手操作的步骤较频繁，因而在实验过程中需要多加注意操作方法。

①在实验进行前应熟悉掌握实验的操作步骤及流程，了解实验操作的方法，以便实验的顺利进行。

②实验应在无菌操作下进行，如可在燃烧的酒精灯附近进行细

菌接种（注意酒精灯安全，切勿灼烧自己或是实验仪器，防止事故的发生）。

③细菌的培养应在适宜的环境下进行，避免外界环境影响细菌的生长繁殖（由于实验室已配备培养箱，故出现问题不大，由于实验室操作者较多，须做好相应的标记）。

④从EMB中挑选单菌落接种时注意不要挑选其他菌落进行接种，防止多种细菌共同出现，影响实验结果。

⑤实验过程中注意操作安全，切勿使细菌沾染自己，如不慎出现细菌沾染，应及时用清水洗净。