08 第八章 真菌毒素的检验

• 酶联免疫吸附试验ELISA （enzyme linked immunosorbent assay） 是一类常用的免疫酶技术。是将已知的抗原或抗体吸附 在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。 常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP) 碱性磷酸酶（AP）。
ELISA方法的基本原理
（1）使抗原或抗体结合到固相载体表面，并保持其免疫活性。
• 步骤： • 1.提取：10g样品+50ml乙腈-水 滤纸过滤 BSA洗液稀释 • 2.测定：包被抗原包被酶标微孔板 洗液洗去多余抗原 加AFB1标准溶液 加稀释抗体（37度1.5h) 洗液洗3 次后，加酶标二抗（ 37度培养2h） 反复洗后加底物溶液 加终止液 • （包被—加样---加酶标抗原和待测抗原---加底物显色—终止反应 • （显色原理对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故 分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与 固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制 酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。
• 5.黄曲霉毒素的检测方法• ①薄层层析法 • 原理：将样品经过提取、浓缩、薄层分离后，在波长365nm紫外 光下产生蓝紫色（B1/B2）或黄绿色荧光（G1/G2) • 提取 检测 薄层板的制备 • 点样 • 展开与观察 • 定量试验 • ②高效液相色谱法 • 提取—净化—衍生—测定 • ③酶联免疫吸附法—竞争抑制法见教材P179
• 霉菌培养特性的鉴定 • 青、曲--察氏培养基，镰刀菌、芽枝霉--马铃薯葡萄糖琼 脂进行划线或点种于琼脂上，25～28℃，定期观察。 • ①生长速度：培养一定天数（5、10、15天）测大小，描 述常以极慢、慢、中等、快、说明。 • ②菌的颜色：包括子实体，气生菌丝、菌核，埋伏菌丝及 其颜色。 • ③菌落表面构造：蔬松，紧密、扁平、隆起，凹陷，或皱 褶，有无同心环，放射沟，并观察菌全部，中心部，中间 部分及边缘部分。 • ④菌落质地：外观似毡状、绒毛状、棉絮状、羊毛状、襄 状、粉粒状、明胶状或皮革状。
（5）单端孢霉烯族化合物 . 头孢菌、镰孢菌、木霉菌等。 侵害玉米、小麦、大米、燕麦、大麦等。 无色结晶、在常温下非常稳定，难溶于水，溶于极性溶剂， 在烹调等加热过程中不会被破坏，在紫外光下不显荧光。 但T-2毒素在紫外光下产生一种具有蓝色荧光物质 • 检测方法：薄层法 • • • •
• （6）玉米赤霉烯酮 • 禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌、木贼镰刀菌 • 具有类似雌激素的作用，可与雌激素受体结合而影响细胞核的 雌激素转录，刺激含雌激素受体的乳腺癌细胞的增长。 • 特性：是一种白色结晶化合物，不溶于水、二硫化碳禾四氯化 碳，微溶于石油醚（30－60），溶于碱性溶液、苯、二氯甲烷、 乙酸乙酯、乙睛和乙醇等。耐热性强，大于110度才能被破坏。 • 易受污染：大麦、小麦、燕麦、稻谷、蚕豆、甘薯、甜菜、芝 麻等、虫害、潮湿气候贮藏不当可诱发产生。 • 分析方法：高效液相色谱法
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4.检测 （1）薄层色谱法 （2）高效液相色谱法 （3）气相色谱法 （4）酶联免疫吸附试验
第二节 主要真菌毒素及其检验
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1.黄曲霉毒素 （1）特性 （2）食品中来源 （3）毒性与危害 （4）检测方法
• 霉菌 • 霉菌均由分枝或不分枝的菌丝构成，许多菌丝交织在一起 形成菌丝体，菌丝在光学显微镜下呈管状，2～10 um 比 一般细菌放线菌细胞大几倍至几十倍，与酵母菌相似，而 其菌丝又分为有隔菌丝和无隔菌丝，再就是根据其功能不 同又分为营养菌丝，气生菌丝。 • 无隔菌丝：菌丝为长管状，单细胞，细胞质内含多个核， 其生长过程只表现为菌丝的延长和细胞核的裂殖增多，以 及细胞质的增加，如毛霉，根霉，犁头霉。 • 有隔菌丝：为大多数的。菌丝由横隔膜分隔成成串的多细 胞，每个细胞内含有一个或多个细胞核，有些菌丝外观看 起来像多细胞，但横隔膜上有小孔，使细胞质或细胞核， 可自由流通，每个细胞功能也相同，如青、曲、白地霉。
（一）双抗体夹心法
酶标抗体和底物
待测抗原
特异性抗体吸 附于固相载体 洗
涤
洗 涤
洗 涤
（二）间接法
酶标抗抗体
待测抗体
洗 涤
洗 涤
洗 涤
（三）竞争法
酶标抗原
待测抗原
洗 涤
洗 涤
酶联免疫竞争法工作原理
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（1）酶联免疫吸附法-竞争抑制法测AFB1 • • • • • • 试剂：TMB，30%H2O2，牛血清白蛋白，吐温-20 抗体：抗AFB1的特异性单克隆抗体 包被抗原：AFB1与载体蛋白的结合物 酶标二抗： 缓冲液：磷酸盐缓冲液、终止液1mol/L的硫酸 AFB1标准溶液：
（2）使抗原或抗体与酶结合成酶标抗原或抗体，并保持抗原或 抗体的免疫活性和酶的活性。 （3）酶标的抗原或抗体与相应的抗体或抗原反应后，结合在免 疫复合物上的酶催化底物形成水解、氧化或还原反应，形成 有色物质，其颜色的深浅与标本中的抗原或抗体 的量直接相 关。
ELISA方法的基本类型 （一） 双抗体夹心法 （二） 间接法 （三） 竞争法
2.真菌毒素分类 • 按产生菌可分为：曲霉毒素类、青霉毒素类、镰刀菌毒素 类等。水活度（Aw对真菌生长和产毒影响较大。 • 真菌毒素毒性： • （1）致DNA损伤，有的致癌； • （2）细胞毒性，有的破坏质膜和细胞酶的作用 • 常见的真菌性食物中毒：黄曲霉毒素中毒、黄变米或灰变 米中毒，赤霉沼渣粉中毒等。
3.真菌毒素检测基本步骤
• 1.采样和样品的准备 • （1）采样的地点 • 根据分析目的的不同确定采样地点，如：农田、仓库、加 工厂、运输工具、零售商和医院等。 • （2）采样方法 • 1）静态样品的采集 • 静态样品：麻袋、箱柜和车厢等容器存放分样品均属静态 样品。 • 采样工具：顶端尖锐的长柄采样钎子。 • 采样数量：小批量时采1/4；大批量时为整批麻袋数
• 4.卫生标准 • 1995年，世界卫生组织制定的食品黄曲霉毒素最高允许浓度为 15μg/kg。 • 美国规定人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒含量(指 B1+B2+G1+G2的总量)不能超过15 μg/kg 。 • 我国的标准 • 玉米、花生、花生油、坚果和干果(核桃、杏仁) ≤ 20 μg/kg。 • 大米、其他食用油(香油、菜籽油、大豆油、葵花油、胡麻油、 茶油、麻油、玉米胚芽油、米糠油、棉籽油) ≤ 10 μg/kg。 • 其他粮食(麦类、面粉、薯干)、发酵食品(酱油、食用醋、豆豉、 腐乳制品)、淀粉类制品(糕点、饼干、面包、裱花蛋糕) ≤ 5 μg/kg。 • 牛乳及其制品(消毒牛奶、新鲜生牛乳、全脂牛奶粉、淡炼乳、 甜炼乳、奶油)、黄油、新鲜猪组织(肝、肾、血、瘦肉) ≤ 0.5 μg/kg。
• 2）动态样品的采集 • 用商品化的十字交叉切分自动采样器 • （3）采样量 • 采大样，按四分法对角连续多次分样缩减至1－2kg，最后取代表 样全部粉碎。 • 美国农业部USDA的方法：成批样每批取3份大样，每份22kg。
• 实验室分析用的样品为1－5kg。
• 2.提取 • 1.提取溶剂 • 溶剂的选择取决于待测毒素的种类、毒素性质、毒素在提取溶 剂中的溶解度、提取溶剂的毒性价格、非测定成分在提取溶剂 中的分配系数等。 • 选用：毒性小、极性大、价格低廉的溶剂系统 • 常用溶剂：甲醇、氯仿、丙酮、己烷、乙酸乙酯、乙睛和水中 一种或多种不同配比的混合物。 • 2.提取温度 • 温度影响毒素的回收率，适当升高温度可以增加毒素的回收率。 • 3.食品基质 • 固体食品：选用浸剂、洗脱、索氏回流等方法。 • 液体食品：液－液分配方法。 • 提取酸性真菌毒素时，通常需提高提取溶剂系统中水相的pH 值，使其有效地将被提取物碱化或形成水溶性碱混合物后，再 进行提取。
• 3. 纯化 • 纯化：在确保不损失待测毒素的前提下除去干扰杂质的过程称 为纯化。 • 常用净化方法： • 液－固萃取、液－液分配、化学吸附、色谱法、透析法以及 SFE法等。 • 使用最广泛的是色谱法。 • 色谱法：薄层色谱法（柱色谱法最常用） • 吸附色谱柱常用的吸附剂： • 硅胶、矾土、氧化铝、活性炭、弗罗里硅土 • 分配色谱柱常用的填充剂：硅藻土、纤维素。 • 固相提取（广泛采用） • 免疫亲和柱IAC（应用于农产品的新技术）
第八章 真菌毒素的检验
主要内容
1.概述 2.真菌毒素分类 3.真菌毒素检测基本步骤
1.概述
• 真菌毒素--由真菌生产的有毒代谢产物。具有毒性、致癌 性、致突变型和致畸性等。“毒蘑菇、迷神麦、醉谷病” • 真菌毒素的危害： • （1）引起粮食作物的病害和产品腐败变质； • （2）对人类和动物健康产生威胁。
• 营养菌丝（基质菌丝）就是在生长过程中，伸入到培养的 基质中，为真菌提供营养的菌丝。 • 气生菌丝图（繁殖菌丝）它主要是伸入到菌周的空气环境 中，它主要作用是产生孢子，产生孢子时的气生菌丝称繁 殖菌丝。 • 霉菌的繁殖 • 主要是由繁殖器官产生孢子，繁殖器管是由繁殖菌丝产生 的可以是单细胞，也可是多细胞，有时产生无性孢子，有 时产生有性孢子，如青霉，曲霉，在生长过程中，由于生 长条件的改变，有时产生有性孢子，有时产生无性孢子， 但主要还是以无性孢子为主。 • 有性孢子：子囊孢子，结合孢子，卵孢子，担孢子。 • 无性孢子：分生孢子，关节孢子，芽生孢子，孢子襄孢子， 厚膜孢子。
• 1.黄曲霉毒素（aflatoxin，AFT)的特性
• AFT目前已分离鉴定出20余种异构体，其中最常见的包括B1、B2、 G1、G2、M1、M2 。
• 特性：
• ⑴紫外线下发不同颜色的荧光，蓝色荧光（Blue fluorescence）为 B族，黄绿色荧光（yellow-Green fluorescence）为G族；M1和M2 为B1、B2的羟化衍生物，主要存在于奶（milk）及奶制品、肉类 （meat）中，故名M族。
• • • •
（7）棒曲霉毒素 苹果青霉、巨大曲霉 毒性：是一种免疫抑制剂，有致癌、致畸等 污染：大麦、小麦、面包、香肠、水果（香蕉、菠萝、葡 萄等），在腐烂的苹果中较高。 • 分析方法：反向高效液相色谱法
• （3）杂色曲酶毒素 • 毒性：引起肿瘤 • 污染：小麦、大麦、玉米、花生、大豆、咖啡豆、火腿、 奶酪等。 • 易溶于氯仿、苯、吡啶、乙睛和二甲基亚砜，微溶于甲醇、 乙醇，不溶于水和碱性溶液。在紫外线照射下，具有砖红 色荧光。 • 检测方法：薄层法，紫外分光光度计测定
• （4）伏马菌素 • 自然界中最为普遍，毒性强，损伤肝肾功能。 • 白色粉末，易溶于水、甲醇、乙睛等溶剂中，在甲醇溶液 中不稳定，在乙睛水溶液中非常稳定。 • 检测方法：高效液相色谱法
• ⑵呋喃环有双键者毒性强，具有致癌性； • ⑶溶于油、氯仿、甲醇等有机溶剂，不溶于水、乙醚、石油醚； • ⑷耐热，加热到280℃才裂解破坏； • ⑸在中性和酸性溶液中稳定，在pH值9-10的强碱性溶液中迅速分 解。
• 2.黄曲霉毒素的毒性 • 急性Leabharlann Baidu性：剧毒物，毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍。 • 慢性毒性：动物生长迟缓，肝脏出现亚急性或慢性损伤。 • 三致作用：致癌、致畸、致突变 。 • 3.黄曲霉毒素产生的影响因素 • 培养基：花生、玉米等是黄曲霉的天然培养基。 • 温度和湿度：最适生长温度在37℃左右，产毒温度略低于 最适生长温度，黄曲霉毒素产毒温度28-32℃，相对湿度 85％以上。 • 水分：产毒的适宜水分活度为0.8-0.9。 • pH值：最适pH值为3 。
固定OD值
微孔板
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微孔表面情况
AFB1包被抗体
• （2）赭曲霉毒素 . • 毒性：主要对肾产生危害，造成肾肿大，当浓度超过 5mg/kg 时，对肝脏组织和肠道产生破坏，引起肠炎等。 • 特性：无色结晶化合物，易溶于极性溶剂和稀的碳酸氢钠水 溶液肿，微溶于水，在紫外光照射下，呈绿色荧光，该化合 物稳定，在乙醇中置冰箱避光保存一年以上而不破坏，但在 谷物中随时间延长而降解。 • 存在于：粮谷物、大豆、葡萄及葡萄酒、咖啡、可可和巧克 力、中草药、调味料、啤酒等。 • 检测方法：液相色谱法、薄层层析法