L-苯丙氨酸的生产
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
五、展望
1、苯丙氨酸生物工程菌构建的成功是令人鼓 舞的。代谢工程在物种改良方面已经展现出了 非常强的生命力. 代谢工程在苯丙氨酸菌种选 育研究中的应用,大幅提升了微生物发酵法的 苯丙氨酸生产效率,但目前仍存在一定程度的 局限性。 2、DNA 重组技术飞跃式发展为微生物合成苯 丙氨酸的代谢工程研究带来了前所未有的机遇。
代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
(2)增加PEP 的合成 磷酸烯醇丙酮酸合成酶(PpsA)和磷酸烯醇丙酮 酸羧激酶(PckA)是糖代谢中心途径中生成磷酸烯 醇丙酮酸(PEP)的2个关键酶,在大肠杆菌中分别由 ppsA和pckA基因编码.扩增ppsA,pckA基因,使这 两个基因单独表达或串联表达,都能提高PEP的合 成量,进而提高DAHP的合成量。
DAHP合成酶(限速反应) 3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸
分支酸 分支酸变位酶(限速反应)
预苯酸
预苯酸脱水酶(限速反应) 苯丙酮酸
四、 L-苯丙氨酸代谢调控
1、增强中心代谢途径代谢流: (1)加强基因aroF的超量表达: DAHP的合成酶DS控制的反应是该途径中的第一个 限速反应。DS是基因aroF、aroG、aroH控制的同 工酶。
代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
3、葡萄糖一直是合成Phe的主要碳源,但随着 研究的深入,显现出很多弊端,如产生葡萄糖 效应和大量副产物乙酸,都会使细菌生长受到 抑制;而甘油价格低廉,容易获得,以甘油为 碳源进行微生物的生产将会成为一种趋势。 总之,虽然目前代谢工程技术在苯丙氨酸 菌种选育中的应用仍然存在许多不足之处,但 代谢工程确实为发酵法高产苯丙氨酸提供了巨 大的推动力,随着研究的深入,必然会为整个 苯丙氨酸产业的发展做出更大的贡献。
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3、解除反馈抑制
aroG基因编码的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷 酸合成酶( AroG)是苯丙氨酸合成途径中的关键 酶之一,受到苯丙氨酸的反馈抑制. 通过使用苯丙氨酸类似物对氟苯丙氨酸(pFP)的 筛选, 获得初步解除对苯丙氨酸的反馈抑制突变 株。通过DNAshuffiing技术有效的对ar0G基因 进行改组,积累并引入有益突变,实现分子的定向 进化,解除AroG的苯丙氨酸反馈抑制。
代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
二、L-苯丙氨酸的生产方法
化学合成法:收率低,副产物多
酶法:工艺路线短,生产能力 强;酶的稳定性差,成本高
微生物发酵法:成本较低、产物纯 度高,对环境的污染相对较小
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三、 L-苯 丙氨酸的 体内代谢 途径
E.coli是最常 应用的菌种。 图为以葡萄糖 作为E.coli生 长的碳源时的 由DAHP生产LPhe的详细路 径图
代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
参考文献
1、黄坤央.苯丙氨酸基因工程菌的构建及其发酵条件研究[D] .郑州 大学.2012.6 2、郝瑞昕; 边英男; 李晓萍等.通过DNA shuffling技术获得初步 解除苯丙氨酸反馈抑制的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶 (AroG)突变株[J] .复旦学报.2010.49(3):287-292 3、赵越,芦佳பைடு நூலகம்黄坤央,徐琪寿,郭军,黄英武.苯丙氨酸生物合 成途径关键基因的串联表达[J] .生物技术通讯.2012.23:488-492. 4、Gerigk M,Bujnicki R,Ganpo-Nkwenkwa E,et al.Process control for enhanced L-Phenylalanine production using different recombinant Escherichia coil strains[j].Biotechnol Bioeng,2002,80(7):746-754 5、刘云;许琪寿.代谢工程及其在产苯丙氨酸基因工程菌构建中的 应用[J] .生物工程进展.2000.20.(3):35-38.
代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
pZE21:含有卡那霉素抗性基因的质粒;pZE12:含有氨 苄林抗性基因的质粒;pZA31:含有氯霉素抗性基因的质粒 CA-AFPT为pZA31-RBS-ppsA-tktA_pZE12-AF的 简 写 CK-AFPT为 pZA31-RBS-ppsA-tktA_pZE21-AF的简写
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(3)改造PTS系统 野生型大肠杆菌体内PEP的消耗主要是磷酰 基转移系统(PTS系统),丙酮酸激酶(pykA/ pykF编码),PEP羧化酶(ppc基因编码)。此通 过改造PTS系统减少PEP的消耗可提高L-Phe产 量。
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2、分支途径代谢调控:
代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
aroG基因编码的3-脱氧-D-阿 拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶是 Phe合成途径中的关键酶之一, 受到苯丙氨酸的反馈抑制.为得 到解除苯丙氨酸反馈抑制的突 变AroG,分别以Escherichia coli (E.coli)野生型和突变型 aroG基因和Salmonella typhimnrium(S.typhimnrium) 野生型aroG基因为亲本,通过 DNA suffling技术对aroG进行 改组,获得的中,在含 有Phe类似物对氟苯丙氨酸(pFP)的培养基上筛选转化子,获 得4个解除Phe反馈抑制的克 隆..
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苯丙氨酸生物合成途径关 键基因的串联表达:
优化关键酶基因 pheA、aroF、 ppsA、 tktA的协同表达
pheA:编码分支酸变 位酶和预苯酸合成 酶。简写成A aroF:编码DHAP合成 酶。简写成F ppsA:编码PEP合成 酶。简写成P tktA:编码转酮酶。 简写成T.
代谢工程在L-苯丙氨酸的 生产中的应用
Diagram
一、 L-苯丙氨酸的简介 二、 L-苯丙氨酸的生产方法 三、 L-苯丙氨酸的体内代谢途径 四、 L-苯丙氨酸的代谢调控 五、展望
代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
一、 L-苯丙氨酸的简介
L-苯丙氨酸是芳香族氨基 酸,是人体八大必需氨基 酸之一。常温下是白色结 晶或结晶性粉末固体,有 L-型、D-型两种消旋体和 DL-型外消旋体,具有生物 活性的是L-型光学异构体, 即L-苯丙氨酸(LPhenylalanine,L-Phe)。
代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
L-苯丙氨酸的 应用
食品业:制成甜味剂 如阿斯巴甜;作为人 必需氨基酸制成保健 食品。
医药业:Phe是一些抗 癌药物甲酸溶肉痛素、 苯丙氨苄等的中间体; 将抗肿瘤药导入靶部位 的载体,或添加于复合 氨基酸输液。
化妆品业:L-Phe广泛 应用于洗发用品和护肤 用品,有滋润和美白皮 肤、亮泽,毛发的作用 。
在pheA、tyrB基因克隆、串联克隆和表达完成的 基础上,将aroG基因和pheA、tyrB基因以aroG-pheAtyrB的顺序三基因串联到表达载体进行表达,提高酶活, 提高L-Phe的产量。
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基因克隆及基 因克隆流程图:
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表:携带不同表达质粒的大肠杆菌的粗抽提物 的酶比活增减倍数